[发明专利]一种真菌菌丝总DNA提取液及提取真菌菌丝总DNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于真菌菌丝总DNA提取的技术领域，特别涉及一种真菌菌丝总DNA提取液及提取真菌菌丝总DNA的方法。

背景技术

在真菌的分子生物学研究中，真菌总DNA的提取至关重要。目前常用的提取方法主要有CTAB法、SDS提取法、尿素提取法及酶解法等。提取的步骤大体相似，关键在于如何有效地破碎细胞壁，有的是通过机械来进行破碎细胞壁，有的是通过酶等物质来消化去壁。由于真菌细胞壁上富含多糖等物质，因此即使是液氮冷冻干燥研磨后也很难被普通抽提液打破，而直接用酶去消化又常常得不到好的去壁效果。事实上，目前大部分实验室所采用的破壁方法均是液氮冷冻干燥研磨，但是这些方法大多会用到有毒有机溶剂、酚等，而且操作时间较长，步骤较多。另外，使用液氮研磨容易冻伤皮肤，需要强力研磨，费时费力，受研钵数量的限制容易产生交叉污染，在研磨过程中真菌菌丝也容易损失，效率也不高，特别是一些单位和机构由于液氮及干冰不易获取而使其受到严重限制。

因此急需一种操作简便且适于DNA微量提取以用于直接进行PCR扩增的技术。

发明内容

针对上述问题，本发明开发了一种真菌菌丝总DNA提取液，其包括提取液I和提取液II；其中所述提取液I包括缓冲盐、非离子表面活性剂、以及中性盐的水溶液，其pH值为7.5-8.5，特别是其pH值可以为7.8-8.2；所述提取液II包括缓冲盐和阳离子表面活性剂，其pH值为7.5-8.5，特别是其pH值可以为7.8-8.2。

使用本发明的真菌菌丝总DNA提取液，可以取得如下的有益效果：

1）实现简化真菌菌丝总DNA提取步骤的目的；

2）适用于真菌菌丝总DNA微量提取，这为难于获得或仅能获得小量的实验材料提供了有效的实验手段；

3）避免了有毒有机溶剂、酚等的使用；

4）可以简化操作步骤，减少操作时间；

5）还避免了液氮研磨过程中容易造成冻伤皮肤的可能性。

在一个具体实施例中，所述阳离子表面活性剂为阳离子聚丙烯酰胺。其浓度可以为0.1-5 ppm，特别是1-3 ppm。

在一个具体实施例中，所述非离子表面活性剂为醇醚硫酸盐；优选地为脂肪醇醚硫酸铵和/或脂肪醇醚硫酸钠；更优选地为C12～C18的脂肪醇醚硫酸铵和/或脂肪醇醚硫酸钠；最优选地为C12～C15的脂肪醇醚硫酸铵和/或脂肪醇醚硫酸钠。

在一个具体实施例中，所述缓冲盐选自Tris-HCl、磷酸钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠中的至少一种。

在一个具体实施例中，所述缓冲盐的浓度为100-200 mM，优选为150-200 mM。

在一个具体实施例中，所述中性盐为氯化盐；优选地，所述氯化盐为氯化钠和/或氯化钾。

在一个具体实施例中，所述中性盐的浓度为100-200 mM，优选为150-200 mM。

在一个具体实施例中，所述真菌为白粉病菌（Cicinnobolus cesatii）。

本发明还提供了一种提取真菌菌丝总DNA的方法，包括如下步骤：

（1）收集真菌菌丝体；

（2）将真菌菌丝体置于如上所述的提取液I；

（3）冻融至少1次，优选冻融至少2次，更优选冻融至少3次；

（4）加入如上所述的提取液II；

（5）去除不溶物，获得含有真菌DNA的上清液。

在一个具体实施例中，以体积计，所述提取液I与所述提取液II的比例为10:(1-5)，优选10:(1.5-2.5)。

在一个具体实施例中，在步骤（3）中，冷冻的温度为零下196°C至零下20°C，融化的温度为40°C至70°C；优选所述冷冻的温度为零下196°C，融化的温度为50°C至60°C。至于冻融的时间，可长可短，一般来讲以能够冻住或解冻即可。

在一个具体实施例中，以离心的方式去除所述不溶物，优选离心速度为10000-15000 rpm，离心时间为1-5分钟。在通过离心去除不溶物后，可以直接使用获得的上清液用于下一步实验操作，例如普通的PCR扩增、RT-PCR扩增等实验。

在一个具体实施例中，还包括步骤（6）将所述上清液中的所述真菌DNA沉淀后溶于TE缓冲液中或去离子水中。经过该处理后，将将提取的DNA长期的冷冻保存，以备后续实验使用。

附图说明