[发明专利]一种LmCas9基因与载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域：

本发明涉及基因编辑技术领域，具体属于一种LmCas9基因与载体及其构建方法，以及LmCas9基因及载体在昆虫基因编辑中的应用。

背景技术：

基因组编辑(Genomeediting)是近年来发展最快的分子生物学技术之一，它的出现和发展为基因组水平的功能研究提供了可能。采用基因组定点编辑技术(ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9)可以在基因组特定位置上造成双链断裂(Doublestrandbreaks，DSBs)，进而通过控制DNA修复途径，实现对基因组的定点修饰。CRISPR/Cas9系统是新崛起的RNA介导的基因组编辑技术，打靶效率高，易于操作，不仅在哺乳动物和线虫等模式生物基因功能研究中广泛应用，也在果蝇、家蚕等昆虫中成功应用。CRISPR全称为成簇规律间隔短回文重复(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)。Cas9蛋白含有RuvC-like和HNH结构域，能够分别切割靶序列的两条链。由CRISPR转录后并经过剪切获得不同的crRNAs，而crRNA则与另外一种反式作用tracrRNA通过局部碱基配对形成嵌合体导向RNA，进而利用crRNA5’端的导向序列与靶位点序列的碱基互补配对介导Cas9蛋白对靶基因的识别和切割。

Cas9蛋白是CRISPR/Cas9基因编辑系统的重要组成部分，Cas9蛋白活性的高低直接影响编辑效率。由于Cas9基因来源于细菌DNA，目前使用较为广泛的人源化的Cas9，但是由于密码子使用的偏好性，同一DNA序列在不同的物种所表达的蛋白含量差异巨大。

为了获得高效地可用于飞蝗的基因编辑工具，本申请通过生物信息学方法设计和合成飞蝗来源的LmCas9，构建其用于基因编辑的pAc-sgRNA-LmCas9载体和基因编辑操作与检测技术。以飞蝗LmCht5-1位点为例，通过构建其靶位点特异性的pAc-Cht5-1sgRNA-LmCas9载体，注射飞蝗受精卵并对其基因组进行编辑，验证飞蝗个体水平的基因编辑系统，并证明了LmCas9的有效性和高效性。该LmCas9基因可用于在飞蝗细胞水平和活体水平对其进行CRISPR/Cas9介导的基因编辑，用于基因功能等研究。该LmCas9基因的合成与应用为昆虫基因功能研究提供工具和技术平台。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种用于昆虫基因编辑的LmCas9基因及载体的合成与应用。

本发明提供的技术方案：

一种LmCas9基因，其核苷酸序列为SEQIDNO：1。

一种pUC57-LmCas9载体，其含有LmCas9基因。

一种pUC57-LmCas9载体的构建方法，包括如下步骤：

利用人源化的huCas9序列作为参照，利用飞蝗种属的密码子偏好性，设计LmCas9序列，使得CAI＝0.89，FOP＝68，将LmCas9的理论密码子使用率优化至最佳。

一种昆虫基因编辑载体pAc-sgRNA-LmCas9，含有LmCas9基因和导向sgRNA。

一种昆虫基因编辑载体pAc-sgRNA-LmCas9的构建方法，包括如下步骤：

利用酶切方法将原载体pAc-sgRNA-huCas9中的huCas9切除，同时用同样的内切酶切割pUC57-LmCas9，然后回收原载体的骨架和LmCas9，连接后构建pAc-sgRNA-LmCas9。

载体pAc-sgRNA-LmCas9在昆虫基因编辑和基因功能研究中的应用。

一种昆虫基因编辑的方法，包括如下步骤：将载体pAc-sgRNA-LmCas9中的sgRNA替换成为任意基因X的靶位点序列XsgRNA，获得pAc-XsgRNA-LmCas9载体，利用转染试剂转染昆虫细胞系或者注射昆虫受精卵，通过酶切或者测序检测来确定候选基因是否被基因编辑。

以上所述的昆虫为飞蝗。

本发明根据飞蝗密码子优化合成LmCas9基因，进一步构建的pAc-sgRNA-LmCas9载体，并用于基因编辑。以飞蝗LmCht5-1位点为例，通过构建其靶位点特异性的pAc-Cht5-1sgRNA-LmCas9载体，注射飞蝗受精卵并对其基因组进行编辑，建立了在飞蝗个体水平的基因编辑系统，证明了LmCas9的有效性和高效性。本发明不仅为飞蝗个体水平的基因编辑提供了工具，也为其他物种的基因编辑工作提供了技术方法。

附图说明：