[发明专利]一种基于线粒体特异片段的近江牡蛎和熊本牡蛎的鉴定方法

说明书

本发明涉及一种基于线粒体特异片段的近江牡蛎和熊本牡蛎的鉴定方法，包括：提取近江牡蛎和熊本牡蛎的基因组DNA；利用上游引物和下游引物对基因组DNA进行PCR扩增，得到目的片段的PCR产物；其中，上游引物为5’‑GTTCCGTTCCATCCTTAT‑3’，下游引物为5’‑AGACCACTTATCCCTCCA‑3’；将PCR产物直接进行凝胶电泳，根据得到的PCR产物条带并结合测序的结果，来判断物种类别。本发明的方法操作简便、成本低、耗时短、准确率高，在水产养殖、资源调查、环境保护中发挥重要作用。

技术领域

本发明属于牡蛎近缘物种鉴定技术领域，特别涉及一种基于线粒体特异片段的近江牡蛎和熊本牡蛎的鉴定方法。

背景技术

牡蛎礁是由大量牡蛎聚集生长于硬底物表面所形成的一种生物礁系统，它广泛分布于温带河口和滨海区。牡蛎礁恢复是养护近岸渔业资源、修复近岸渔业水域生态系统的重要手段之一。近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)和熊本牡蛎(Crassostrea sikamea)共存分布于长江口、杭州湾及江苏沿岸，是我国东海区的主要造礁牡蛎物种。但针对特殊的区域选择哪种牡蛎开展牡蛎礁恢复工程可以达到更好的生态恢复效果尚属未知。而两者的物种鉴别，是开展生态修复的前提。另外，牡蛎是国内外主要的经济贝类之一，营养价值和经济价值颇高。牡蛎养殖是贝类养殖业中的支柱产业。

由于牡蛎贝壳的形态可塑性强，易受环境影响，因此，仅凭外部形态有时很难区分具体种类，尤其牡蛎幼体和稚贝更是如此。这既是贝类分类学上的一个难题，也对牡蛎养殖、野外资源保护和可持续开发利用、以及生态修复工作不利。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于线粒体特异片段的近江牡蛎和熊本牡蛎的鉴定方法，该方法操作简便、成本低、耗时短、准确率高。

本发明的一种基于线粒体特异片段的近江牡蛎和熊本牡蛎的鉴定方法，包括：

(1)提取近江牡蛎和熊本牡蛎的基因组DNA；

(2)利用上游引物和下游引物对步骤(1)中的基因组DNA进行PCR扩增，得到目的片段的PCR产物；其中，上游引物为5’-GTTCCGTTCCATCCTTAT-3’，下游引物为5’-AGACCACTTATCCCTCCA-3’；

(3)将步骤(2)中的PCR产物直接进行凝胶电泳，根据得到的条带初步判断两个物种的有无，进一步结合测序结果准确鉴别这两个物种的类别。

所述步骤(1)中基因组DNA为近江牡蛎和熊本牡蛎肌肉组织中总基因组DNA；提取方法为酚-氯仿法提取。

所述酚-氯仿法为经典的酚-氯仿法，具体为：

(1)消化前的处理。

用滤纸吸干样品中的液体，取适量背部组织加至相应的离心管中，加入1000μL的终浓度1mol/L的Tris-Cl(pH＝8.0)于离心管中，用灭菌的手术剪充分剪碎，室温放置1h。4℃，12000rpm/min，离心10min。去上清液。

(2)消化。

分别向离心管中，加600μL的Tris buffer，50μL的10％的SDS，10μL的蛋白酶K，于振荡仪上振荡混匀。置于56℃水浴锅中，水浴过程中多次人工混匀，直至消化至澄清。

(3)DNA的抽提及纯化。

加饱和苯酚(Phenol saturated)350μL，350μL氯仿/异戊醇(25:24:1)，颠倒摇匀10min。4℃，12000rpm/min，离心10min。取上清液。重复上述步骤，进行第二次抽提。取上清液。加等体积的氯仿/异戊醇，混匀10min。4℃，12000rpm/min，离心10min。取上清液。

(4)DNA的沉淀及干燥。