[发明专利]一种羊肚菌原生质体的高效制备方法在审
| 申请号： | 201610165040.0 | 申请日： | 2016-03-22 |
| 公开（公告）号： | CN105647820A | 公开（公告）日： | 2016-06-08 |
| 发明（设计）人： | 谭俊呈;黄建星;兰健勇;陈振坤;易弋 | 申请（专利权）人： | 广西生众生物科技开发有限公司 |
| 主分类号： | C12N1/14 | 分类号： | C12N1/14;C12R1/645 |
| 代理公司： | 柳州市荣久专利商标事务所(普通合伙) 45113 | 代理人： | 韦微 |
| 地址： | 545006 广西壮族自治区柳*** | 国省代码： | 广西;45 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 种羊 原生 质体 高效 制备 方法 | ||
1.一种羊肚菌原生质体的高效制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
⑴按常规方法收集新鲜羊肚菌孢子后，将孢子置于液体培养基中于35-40℃培养，孢子培养液初始浓度为5×105~5×106个/ml；所述液体培养基是在常规PD培养基的基础上添加CuCl2至终浓度为10mmol/L；
⑵培养4-6天后，离心收集菌体，再使用0.15mol/L的pH7.0的PBS缓冲液重悬菌体；PBS缓冲液与步骤⑴液体培养基体积比为1:8-1:12；
⑶将重悬后的菌体与直径0.2mm的石英砂按体积比2:1混合后，置于漩涡振荡器上振荡15-30min；
⑷将震荡后的菌体过滤2次；
⑸收集过滤液离心处理，菌体用等体积0.15mol/L的pH7.0的PBS缓冲液洗涤2次后，再重悬于4-6倍体积的0.15mol/L的pH7.0的PBS缓冲液中；
⑹向重悬液中添加溶壁酶至终浓度10-15mg/ml，添加蜗牛酶至终浓度10-15mg/ml，30℃处理1-3h；
⑺将酶处理后的细胞于离心处理，沉淀经等体积0.5mol/L的ZnCl2溶液洗涤2次后，重悬于等体积的ZnCl2溶液中，即获得羊肚菌原生质体溶液。
2.根据权利要求1所述的一种羊肚菌原生质体的高效制备方法，其特征在于：步骤⑸离心处理是在5000rpm离心5min。
3.根据权利要求1所述的一种羊肚菌原生质体的高效制备方法，其特征在于：步骤⑺离心处理是在3500rpm离心3min。
4.根据权利要求1所述的一种羊肚菌原生质体的高效制备方法，其特征在于：步骤⑷第一次过滤使用150目滤布，第二次使用800目滤布。
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