[发明专利]一种羊肚菌原生质体的高效制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种羊肚菌原生质体的高效制备方法。

背景技术

食用菌常规的菌种选育可分为自然选育和人工选育，人工选育又分为诱变育种、杂交育种和原生质体融合育种。自然选育虽然选育目的性很强，但是效果是相对的，有条件的，从本质上将不能改变个体的基因型，而只是积累并利用其自然条件下发生的有益变异，既费时又费力。诱变育种尽管具有速度快、收效大、方法比较简便等优点，但其遗传突变率较大，存在盲目性。杂交育种虽然具有一定的定向性，但由于食用菌是有极性的真菌，因不亲合性及细胞壁的存在使得杂交育种受到一定的限制。食用菌原生质体育种研究虽起步较晚，但发展很快。它比传统的杂交育种具有明显的开拓性。由于原生质体育种具有不受亲缘关系的影响、遗传信息传递量大、不需了解双亲详细的遗传背景等优点，因而便于操作，使得食用菌在属间、科间甚至更高分类层次上的杂交成为可能。

有效制备原生质体是原生质体育种的第一步，由于不同原生质体之间的融合概率低，以及存在再生率，融合子筛选等问题，使成功获得融合子的概率非常低，因此使用数量巨大的原生质体进行融合是保证原生质体育种成功的有效途径。现有的报道中，获取原生质体普遍采用酶解菌丝的方法，但该方法获取原生质体的效率偏低，且酶解条件不易控制。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种羊肚菌原生质体的高效制备方法，该方法通过先制备单细胞悬液，然后酶解制备原生质体，在此过程中通过添加金属离子控制菌丝生长和稳定原生质体，有效的提高了原生质体的制备效率。

解决上述技术问题的技术方案是：一种羊肚菌原生质体的高效制备方法，包括以下步骤：

⑴按常规方法收集新鲜羊肚菌孢子后，将孢子置于液体培养基中于35-40℃培养，孢子培养液初始浓度为5×10⁵~5×10⁶个/ml；所述液体培养基是在常规PD培养基的基础上添加CuCl₂至终浓度为10mmol/L；

⑵培养4-6天后，离心收集菌体，再使用0.15mol/L的pH7.0的PBS缓冲液重悬菌体；PBS缓冲液与步骤⑴液体培养基体积比为1:8-1:12；

⑶将重悬后的菌体与直径0.2mm的石英砂按体积比2:1混合后，置于漩涡振荡器上振荡15-30min；

⑷将震荡后的菌体过滤2次；

⑸收集过滤液离心处理，菌体用等体积0.15mol/L的pH7.0的PBS缓冲液洗涤2次后，再重悬于4-6倍体积的0.15mol/L的pH7.0的PBS缓冲液中；

⑹向重悬液中添加溶壁酶至终浓度10-15mg/ml，添加蜗牛酶至终浓度10-15mg/ml，30℃处理1-3h；

⑺将酶处理后的细胞于离心处理，沉淀经等体积0.5mol/L的ZnCl₂溶液洗涤2次后，重悬于等体积的ZnCl₂溶液中，即获得羊肚菌原生质体溶液。

步骤⑸离心处理是在5000rpm离心5min。

步骤⑺离心处理是在3500rpm离心3min。

步骤⑷第一次过滤使用150目滤布，第二次使用800目滤布。

采用现有方法制备原生质体，每批次之间的制备率变化很大，这是因为制备过程是用菌丝直接进行酶解，酶解过程不能很好的控制，所以制备的原生质体的量很难上去。本发明是通过先制备单细胞悬液，然后酶解制备原生质体，在此过程中通过添加金属离子控制菌丝生长和稳定原生质体，有效的提高了原生质体的制备效率，能在短时间内制备大量的羊肚菌原生质体，为后续的育种奠定基础。

该方法除了可以应用在羊肚菌原生质体的制备上，还可用于平菇、香菇、金福菇、双孢菇、松茸、金针菇、茶树菇等多种食用菌的原生质体制备上。

具体实施方式

实施例1：一种羊肚菌原生质体的制备方法，包括以下步骤：

1.按常规方法收集羊肚菌孢子后，将孢子置于液体培养基中于35-40℃培养，孢子培养液初始浓度为5×10⁵~5×10⁶个/ml。该培养基是在常规PD培养基的基础上添加CuCl₂至终浓度为10mmol/L。

2.培养4-6天后，离心收集菌体，再使用0.15mol/L的pH7.0的PBS缓冲液重悬菌体。PBS缓冲液与原培养液体积比为1:8-1:12。

3.将重悬后的菌体与直径0.2mm的石英砂按体积比2:1混合后，置于漩涡振荡器上振荡15-30min。