[发明专利]氨基糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌检测用标准样品及制法

权利要求书

1.氨基糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌检测用标准样品，其特征是，标准样品含有冻干 的细菌混合物与冻干保护剂，采用西林瓶真空包装，其中细菌混合物包括氨基糖苷类耐药 性金黄色葡萄球菌。

2.根据权利要求１所述的氨基糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌检测用标准样品，其特征 是，所述标准样品每瓶装样量为1克，平均每份样品中含有2.0-4.0×10⁶cfu目标菌。

3.氨基糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌检测用标准样品的制法，其特征是，具体过程如 下：

第一步菌株活化、增菌培养及纯化：

所用标准菌株来源于美国标准菌种收藏所，标准菌株号ATCC51329，氨基糖苷类耐药 性金黄色葡萄球菌标准菌株进行菌株活化、增菌培养，进行生化鉴定和药敏试验；

第二步样品制备：

采用真空冷冻干燥方式制备，将灭菌蒸馏水中加入保护剂，再次煮沸灭菌；冷却后加入 活化的红霉素耐药性金黄色葡萄球菌，混匀；分装至无菌干燥西林瓶中，真空冷冻干燥；

第三步细菌鉴定及耐药性测定：

取制备的标准样品进行鉴定，经采用生化鉴定和药敏试验分析，确认所制备的标准样 品为氨基糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌标准样品；

第四步均匀性试验：

采用在基体中添加氨基糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌形成大样，然后充分混匀并分装 的方法制备100份标准样品；根据以往的研究结果，在充分混匀的大样中目标菌服从泊松分 布，大样中目标菌添加量为2.0-4.0×10⁸cfu，平均每份样品中含有2.0-4.0×10⁶cfu目标 菌；按照泊松分布计算，每个样品中含有2.0-4.0×10⁶cfu目标菌的概率为99.81%；每瓶 样品中的目标菌量被控制在2.0-4.0×10⁶cfu之间，样品的均匀性得以保证；

第五步稳定性试验

该标准样品的稳定性经过两年的测定，氨基糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌标准样品在 干燥条件下，避光、密封，冷冻贮存，两年内稳定。

4.根据权利要求３所述的氨基糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌检测用标准样品的制法， 其特征是，所述标准样品在稳定性试验后进行第六步不确定度评估：

按照GUM，确定氨基糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌含量W的测量不确定度模型；W的合成 标准不确定度远远大于瓶内不均匀性和瓶间不均匀性所带来的标准不确定度，因此，可以 忽略瓶内不均匀性和瓶间不均匀性对标准样品定值不确定度的影响；其中所添加的氨基糖 苷类耐药性金黄色葡萄球菌为100％纯物质，其不确定度也可以忽略；

取包含因子k=2，标准样品中氨基糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌含量扩展不确定度为 0.11％。

5.根据权利要求３或４所述的氨基糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌检测用标准样品的制 法，其特征是，所述第二步样品制备的具体工艺如下：

a.在恒温恒湿、无菌操作间中，制备含有2.0-4.0×10⁸cfu的大样，混匀上述样品；

b.将混合样品放置于中试冻干机中低温真空冷冻干燥制备成混合冻干粉；

c.将混合冻干粉样品分装于经160℃干热处理2h的洁净的7mL棕色玻璃瓶中封盖密 封，每瓶内装混合冻干粉样品1g，最后所有分装好的样品经60CO4kGy辐照1h；

d.获100瓶含有氨基糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌的标准样品，瓶装后的样品加贴唯 一性标识，冷冻贮存。

6.根据权利要求5所述的氨基糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌检测用标准样品的制法， 其特征是，所述b.中冷冻干燥：

将a步骤中制备好的菌液分装0.5mL/瓶，放置橡胶盖，但不要塞紧，置于中试冻干机中 低温真空冷冻干燥，制备成混合冻干粉；

冷冻工艺如下：

1）预冷阶段：隔板温度5℃；

2）冷冻阶段：设置隔板温度为10℃，每个阶段降低10℃，至-50℃，每个温度阶段运行时 间分别为1h；

3）主干燥阶段：隔板温度-50℃，运行时间0.5h，真空度0.2mbar；隔板温度-40℃， 运行时间7h，真空度0.4mbar；隔板温度-35℃，运行时间7h，真空度0.6mbar；隔板温度- 25℃，运行时间5h，真空度0.8mbar；隔板温度-15℃，运行时间4h，真空度1.0mbar；隔板 温度-5℃，运行时间2h，真空度1.2mbar；

4）二次干燥阶段：隔板温度0℃，运行时间3h，真空度0.0010mbar；隔板温度15℃， 运行时间3h，真空度0.0010mbar；隔板温度25℃，运行时间3h，真空度0.0010mbar。