[发明专利]与日本囊对虾耐热性相关的SNP标记及其检测方法

权利要求书

1.与日本囊对虾耐热性相关的SNP标记，其特征在于其核酸序列为SEQ ID NO.1的HSP60基因的第3289位点，其碱基为A或G。

2.聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性检测方法，其特征在于对直接测序法得到的MjHSP60基因3289A/G进行检测，确定该位点与热耐受性状的相关性；

用于PCR-RFLP检测的引物，其上下游序列分别为：

HSP60NF5：CCGTGGCTACATCTCGC；

HSP60NR5：TCTTCAAGCGGTTCACTACA。

3.如权利要求1所述与日本囊对虾耐热性相关的SNP标记的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)日本囊对虾耐热性实验步骤；

2)热耐受值的计算步骤；

3)利用PCR-RFLP技术进行基因分型步骤；

4)不同基因型日本囊对虾个体热耐受性分析步骤。

4.如权利要求3所述与日本囊对虾耐热性相关的SNP标记的检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述日本囊对虾耐热性实验步骤如下：

将日本囊对虾在33℃水体中暂养1d后，以1℃/2h的速率升温直至所有对虾死亡，找出38℃为死亡率较高拐点；以33℃为初始温度，选取经1d暂养正常的个体放入实验池，以1℃/2h的速率升温至38℃；38℃之后以0.5℃/4h的速率升温直至所有日本囊对虾死亡；实验中保持充气，以确保水池中各个部位温度同步；对虾死亡标准为对虾背部朝下倒于水体无法恢复正常的姿势或躯体始终保持90°弯曲；记录死亡时间、死亡温度、体重，然后装入封口袋中，以供实验结束后保存样品，保证每10min捞取一次死虾并做好记录，当池子中对虾死亡总数达到100％时结束耐热实验。

5.如权利要求3所述与日本囊对虾耐热性相关的SNP标记的检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述热耐受值的计算按以下公式：

式中，i为分钟数，T_i为在第i分钟的温度，T₀为实验初始温度33℃，k为个体存活的分钟数。

6.如权利要求3所述与日本囊对虾耐热性相关的SNP标记的检测方法，其特征在于在步骤3)中，所述利用PCR-RFLP技术进行基因分型的具体方法为：

a)随机选取40～80尾体重在2.3～3.3g之间的已获得热耐受性状评定指标UTT值的日本囊对虾，取每尾虾的背部肌肉，置于无水乙醇中，-20℃保存，用于基因组DNA的提取；提取基因组DNA后，利用特异性引物HSP60F5和HSP60R5进行PCR扩增，扩增产物经限制性内切酶BstXⅠ酶切，根据酶切后电泳条带确定不同的基因型；酶切体系如下：

反应条件：37℃水浴，15min；

b)利用PCR-RFLP方法对SNP标记3289A/G进行分型，经BstXⅠ酶切后，3289A型等位基因产生长度分别为333bp和68bp的两种片段，而3289G由于不能为BstXⅠ酶所识别，基因片段长度仍为401bp；酶切产物经1.5％电泳检测后，发现存在2种基因型：3289AA基因型和3289AG基因型。

7.如权利要求3所述与日本囊对虾耐热性相关的SNP标记的检测方法，其特征在于在步骤4)中，所述不同基因型日本囊对虾个体热耐受性分析的具体方法为：

对具不同基因型的日本囊对虾个体(2.3～3.3g)进行热耐受性方差分析对比。