[发明专利]以子叶节为外植体建立葫芦高效再生体系的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种以子叶节为外植体建立 葫芦高效再生体系的方法。

背景技术

葫芦(LagenariasicerariaStandl.)为葫芦科(Cucurbitaceae)葫芦属，一年 生草本植物。起源于非洲。其嫩果可食用，成熟果可做容器。此外，葫芦还具 有一项特别的用途，即可用作西瓜甜瓜的嫁接砧木。最初采用葫芦嫁接的目的 是控制西瓜枯萎病(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)。枯萎病是西瓜生产上一种 毁灭性的土传病害，属于尖孢镰刀菌西瓜专化型，在西瓜整个生育期均会发生， 病菌主要以菌丝、厚垣孢子或菌核为主要侵染源，重茬地一般发病严重，甚至 绝收。通过嫁接，利用葫芦砧木高抗或免疫的特点，有效地提高了西瓜对土传 病害的抗性，同时由于其可有效克服连作障碍、减少环境污染，加上操作方便、 适合规模育苗以及能有效提高西瓜抗逆性等综合优势，因此在生产中得以广泛 应用。

国内外大量实验证明葫芦砧木不但能提高西甜瓜对土传病害的抗性，还能 增强西甜瓜对其他病(疫病、白粉病、果腐病、黄萎病等)、虫(根结线虫) 害和病毒病的抵抗能力。同时，葫芦砧木嫁接也提高了西甜瓜对非生物逆境如 低温胁迫的抵抗力。

优良葫芦砧木新品种的选育和配套的嫁接栽培技术是西甜瓜嫁接栽培成功 的关键。传统的葫芦遗传改良主要采用常规育种方法，通过杂交选育F1代杂交 种。但是，葫芦常规育种周期长、难度大且遗传性状不稳定，极大地制约了优 良葫芦砧木品种的选育进程。相比之下，转基因技术具有操作简单、成本低、 育种周期短的特点，广泛应用于作物改良。采用基因工程技术手段进行种质创 新，首先要建立高效的植株再生体系。目前在葫芦科作物中已有黄瓜、甜瓜、 西瓜、笋瓜等报道了植物再生体系，而鲜见有关葫芦的组织培养相关的研究报 道。再生体系的建立受到基因型、外植体类型、组织培养条件(如培养基类型、 激素水平等)等因素的影响。虽然葫芦科其他作物已建立了再生体系，但由于 葫芦科作物遗传基础狭窄，已有的再生体系不能成功应用于葫芦，在实际操作 过程中重复性差，且再生率极低。因此，急需研发一种高效、稳定且简便易行 的葫芦再生体系，为进一步通过基因工程手段进行葫芦的种质创新和遗传改良， 进而培育优良葫芦砧木新品种奠定基础。

发明内容

本发明主要提供了一种以子叶节为外植体建立葫芦高效再生体系的方法， 提供的方法不仅芽诱导率高、操作简单、易于实施，适用于葫芦种质创新、遗 传改良等基因操作。其技术方案如下：

一种以子叶节为外植体建立葫芦高效再生体系的方法，包括以下步骤：

(1)挑取成熟饱满的种子，去壳得籽粒，将籽粒做消毒处理，再转接到无 激素的MS基础培养基上黑暗环境下恒温培养至种子萌发，获得无菌苗；

(2)取无菌苗，切去胚芽和下胚轴，分开子叶，每半片子叶横切，获得子 叶节外植体；

(3)将子叶节外植体接种于不定芽诱导培养基MS1中培养，期间定期更 换培养基，获得不定芽簇；

(4)将不定芽簇从外植体上剥离，转接至继代培养基MS2中，继续培养， 期间定期更换培养基，待不定芽长到3-4cm高时，分开不定芽簇，获得单个不 定芽苗；

(5)将单个不定芽苗转接至生根培养基MS3中，培养至生根；

(6)将生根的再生植株进行炼苗处理；

(7)炼苗完成后，取出幼苗，洗去根部培养基，移栽于育苗基质中，放于 温室培养。

优选的，步骤(1)中对籽粒消毒处理的方法为，先用体积含量为70％的无 水乙醇对籽粒表面消毒35-45S，用无菌水冲洗2-3次，再用质量浓度为10％的 NaClO消毒8-12min，再用无菌水冲洗2-3次，最后置于无菌滤纸上控干水分。

优选的，步骤(2)中选取萌发3d的无菌苗。

优选的，步骤(3)中不定芽诱导培养基MS1包括：MS培养基、3.0mg·L^-1的6-BA、0.01mg·L^-1的2,4-D、0.3mg·L^-1的AgNO₃、30g·L^-1的蔗糖和8g·L^-1的琼脂，不定芽诱导培养基MS1的pH为5.6-6.0。