[发明专利]牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法

权利要求书

1.牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法，其特征在于，该方法包含以下步骤：

步骤a.祖细胞提取和培养

选择并提取第三磨牙的牙周膜干细胞和牙龈间充质干细胞，要求：18-25岁的健康男性成人，无牙周病史；

为评估克隆形成，在培养皿中植入0.1*10⁶个细胞并培养14天，再用甲苯胺蓝染色，将超过50个细胞数的克隆作为一个阳性CFU-F。实验组选用第四代细胞，人骨髓间充质干细胞作为阳性对照组；

步骤b.细胞流式分析

选取数量约为5*10⁵个第四代细胞，用PE或者FITC鼠单克隆抗人CD34和CD45流式抗体孵育，以及CD73、CD105、CD146、CD166(间充质干细胞表面标志物)或lgGs作为同型对照；

步骤c.生物材料的制备

采用高浓度古罗糖醛酸的RGD-coupled藻酸盐，对其进行处理以提高降解性，并与TGF-β1混合；

步骤d.细胞的包被

选取PDLSC和GMSC以及作为阳性对照的hBMMSC以2*10⁶cells/ml的密度包被在上述藻酸盐中以形成微球。

2.根据权利要求1所述的牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法，其特征在于：所述步骤c中的生物材料的制备还包括以下分步骤：

分步骤1：选取高浓度古罗糖醛酸的RGD-coupled藻酸盐；

分步骤2：为提高上述藻酸盐的生物降解性，将其进行纯化处理，以及部分氧化(2％)处理；

分步骤3：将上述经过处理后的藻酸盐与TGF-β1(500ug/ml)充分搅拌混合，浓缩、真空冻干。

3.根据权利要求1所述的牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法，其特征在于：所述步骤d中的细胞包被还包括以下分步骤：

分步骤1：将PDLSC和GMSC以及阳性对照的hBMMSC以2*10⁶cells/ml的密度包被在上述藻酸盐中；

分步骤2：采用注射器将藻酸盐(200ul/h)和大豆油(100ml/h)注入微流体装置，藻酸盐被大豆油分离成液滴；

分步骤3：将上述液滴逐滴滴入装有100mM CaCl₂溶液的petri盘中进而形成微球；

分步骤4：将上述微球置于37℃环境下孵育45分钟从而完成交联；

分步骤5：采用DMEM清洗上述微球，清洗三遍。