[发明专利]牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域，尤其是涉及一种牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法。

背景技术

间充质干细胞分化再生软骨是一种优良的组织工程方法，间充质干细胞是一种能接受天然微环境信号而多向分化的多能干细胞。当提供合适的生长因子，间充质干细胞在细胞球状培养和多种生物材料中能生成软骨和分泌软骨特有基质。

在牙源性间充质干细胞中，牙周膜干细胞和牙龈间充质干细胞因其易从口腔和牙科操作废弃的生物组织中获取而拥有独特优势，且通过体内体外试验均验证了这些牙源性间充质干细胞的多向分化能力。

间充质干细胞有效分化为软骨细胞需要核实的微环境和信号分子，如TFG-β1、BMP-4和FGF-2等生长因子。干细胞载体对于干细胞体内活动和再生过程也具有重要作用。

因此，通过改造干细胞外基质的理化性质来设计一种合适的微环境，以创造合适的干细胞环境，而引导干细胞分化为特定表型。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法，为实现上述方法本发明提供如下技术方案：

牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

步骤a.祖细胞提取和培养

选择并提取第三磨牙的牙周膜干细胞和牙龈间充质干细胞，要求：18-25岁的健康男性成人，无牙周病史。

为评估克隆形成，在培养皿中植入0.1*10⁶个细胞并培养14天，再用甲苯胺蓝染色，将超过50个细胞数的克隆作为一个阳性CFU-F。实验组选用第四代细胞，人骨髓间充质干细胞作为阳性对照组。

步骤b.细胞流式分析

选取数量约为5*10⁵个第四代细胞，用PE或者FITC鼠单克隆抗人CD34和CD45流式抗体孵育，以及CD73、CD105、CD146、CD166(间充质干细胞表面标志物)或lgGs作为同型对照。

步骤c.生物材料的制备

采用高浓度古罗糖醛酸的RGD-coupled藻酸盐，对其进行处理以提高降解性，并与TGF-β1混合。

步骤d.细胞的包被

选取PDLSC和GMSC以及作为阳性对照的hBMMSC以2*10⁶cells/ml的密度包被在上述藻酸盐中以形成微球。

所述步骤c中的生物材料的制备还包括以下分步骤：

分步骤1：选取高浓度古罗糖醛酸的RGD-coupled藻酸盐；

分步骤2：为提高上述藻酸盐的生物降解性，将其进行纯化处理，以及部分氧化(2％)处理；

分步骤3：将上述经过处理后的藻酸盐与TGF-β1(500ug/ml)充分搅拌混合，浓缩、真空冻干。

所述步骤d中的细胞包被还包括以下分步骤：

分步骤1：将PDLSC和GMSC以及阳性对照的hBMMSC以2*10⁶cells/ml的密度包被在上述藻酸盐中；

分步骤2：采用注射器将藻酸盐(200ul/h)和大豆油(100ml/h)注入微流体装置，藻酸盐被大豆油分离成液滴；

分步骤3：将上述液滴逐滴滴入装有100mM CaCl₂溶液的petri盘中进而形成微球；

分步骤4：将上述微球置于37℃环境下孵育45分钟从而完成交联；

分步骤5：采用DMEM清洗上述微球，清洗三遍。

本发明所提供的方法有益效果是：利用RGD修饰的藻酸盐所具有的独特的三维支架结构，并添加有TFG-β1配体，包被着牙源性间充质干细胞，产生最佳的软骨再生效果，有望应用于颞下颌关节盘的重建和四肢骨骼修复。这种材料能够支持PDLSCs和GMSCs在体内和体外的存活、新陈代谢和成软骨分化，有望将其运用于颞下颌关节盘的软骨再生种子细胞。本系统包埋牙源性间充质干细胞容易操作，是一个三维可注射可生物降解的软骨组织工程细胞运载支架。

附图说明

图1是本发明的步骤流程示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例：参照图1所示，本发明所提供的一种牙源性间充质干细胞实现软骨再生的方法包括以下步骤：