[发明专利]一种经无菌化处理的雨生红球藻的超低温保藏方法

权利要求书

1.一种经无菌化处理的雨生红球藻的超低温保藏方法，包括：

1）在处于指数生长后期的雨生红球藻藻液中加入终浓度为100～500ug/ml的氨苄青霉素，培养1～3天，继续加入终浓度为1～10ug/ml的庆大霉素，培养1～3天，继续加入终浓度为1～10ug/ml的卡那霉素，再培养2天；取经无菌化处理后的藻液涂布于LB平板上，初步认定无菌后，再经3次传代培养，彻底消除残留抗生素的影响，再次用LB平板进行无菌检测，经检测无菌的雨生红球藻用于超低温保藏；

2）将雨生红球藻厚壁孢子液和甘油按体积比为1:1进行混合，使得混合液中细胞密度的终浓度为1.5×10⁵~5×10⁵个/ml，甘油的终浓度为5~25%，室温静置5~20min，然后放入程序降温仪中，0.5℃/min～5℃/min，预冻至-30℃～-80℃，在此温度保持30min～120min，然后放入液氮罐中保存。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：氨苄青霉素的终浓度为100～400ug/ml，培养1～2天，继续加入终浓度为1～8ug/ml的庆大霉素，培养1～2天，继续加入终浓度为1～8ug/ml的卡那霉素，再培养2天。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：氨苄青霉素的终浓度为100～300ug/ml，培养1～2天，继续加入终浓度为1～5ug/ml的庆大霉素，培养1～2天，继续加入终浓度为1～5ug/ml的卡那霉素，再培养2天。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：氨苄青霉素的终浓度为300ug/ml，培养2天后，继续加入终浓度为5ug/ml的庆大霉素，培养2天，继续加入终浓度为5ug/ml的卡那霉素，再培养2天。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：甘油的终浓度为5%～15%；降温速率为0.5℃/min～2℃/min，预冻至-30℃～-60℃，在此温度保持30min～60min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：甘油的终浓度为15%；混合液中细胞密度的终浓度为5×10⁵个/ml；降温速率为1℃/min，预冻至-40℃，保持30min。

7.根据权利要求1所述的方法，雨生红球藻低温保藏后，复苏的方法包括：在液氮罐中保藏三个月后，将样品取出，迅速放入20℃～60℃水浴中进行化冻，直至最后一个冰晶消失，然后至于离心机中进行5000rpm离心5min，加入已灭菌的BG11培养基重悬，再次离心，转速为5000rpm，离心时间为5min；将离心后的藻细胞接种于新鲜BG11培养基中，培养7d后用细胞计数板测定它们的细胞密度。