[发明专利]一种经无菌化处理的雨生红球藻的超低温保藏方法

说明书

技术领域

本发明涉及到具有高附加值的微藻培养的技术领域，更具体涉及一种经无菌化处理的 雨生红球藻种质的超低温保藏方法

背景技术

雨生红球藻，隶属于绿藻门(Chlorophyta)绿藻纲(Chlorophyceae)团藻目(Volvocales)红 球藻科(Haematococcaceae)红球藻属(haematococcus)，在环境不良时，其绿色游动细胞转化 为红色静止细胞，并积累虾青素。虾青素是一种高价值的生物活性产物，具有强大的抗氧 化活性，在水产养殖、食品、化妆品、药品等行业中有广泛用途。由于雨生红球藻中的虾 青素含量最高，被公认为自然界中虾青素的最好生物来源，因此已成为近年藻类开发应用 的热点。而雨生红球藻的无菌化是高密度养殖等开发应用及生理生化研究的基础和关键性 环节。而如何保持藻种的无菌化及优良品质也是制约红球藻开发研究的瓶颈问题之一。

微藻的无菌化处理包括物理方法和化学方法，物理方法如稀释涂布法、超声波清洗 法、紫外辐射法等，但物理方法一般难以得到纯的株系，化学方法一般用抗生素方法。抗 生素对细菌的生长繁殖有很强抑制作用。利用绿藻对于抗生素耐受能力比细菌强的特点， 采用抗生素处理绿藻，可获得无菌株系。但过高的抗生素浓度将导致藻种的死亡，而过低 的抗生素浓度则对藻液中的细菌无抑制作用。且不同抗生素类型以及不同的添加顺序对于 藻液中细菌的抑制能力也存在差异。

传统的液体继代保藏藻种的方式存在操作繁琐、工作量大、容易污染，遗传漂变、藻 种优良性状退化等问题。藻类种质超低温保存技术具有保持种质遗传稳定性、便于长期保 存、能最大程度地减小污染等方面的优点，因此越来越受到关注，并广泛应用于大量微藻 的长期保藏。而对于雨生红球藻超低温保藏，由于受到多种因素的影响，因此还未有相关 技术报道。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种经无菌化处理的雨生红球藻的超低温保藏方法，利用 本发明的方法，可使藻株达到无菌化，保持藻株的优良性状，以便进行藻种高密度养殖等 开发应用及生理生化研究。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种经无菌化处理的雨生红球藻的超低温保藏方法，包括：

1)在处于指数生长后期的雨生红球藻藻液中加入终浓度为100～500ug/ml的氨苄青霉 素，培养1～3天，继续加入终浓度为1～10ug/ml的庆大霉素，培养1～3天，继续加入终 浓度为1～10ug/ml的卡那霉素，再培养2天；取经无菌化处理后的藻液涂布于LB平板 上，初步认定无菌后，再经3次传代培养，彻底消除残留抗生素的影响，再次用LB平板 进行无菌检测，经检测无菌的雨生红球藻用于超低温保藏。

以上的培养条件均为室温(20～25摄氏度)静置培养。

以上所述方法中，优选的氨苄青霉素的终浓度为100～400ug/ml，培养1～2天，继续 加入终浓度为1～8ug/ml的庆大霉素，培养1～2天，继续加入终浓度为1～8ug/ml的卡那 霉素，再培养2天。

以上所述方法中，优选的氨苄青霉素的终浓度为100～300ug/ml，培养1～2天，继续 加入终浓度为1～5ug/ml的庆大霉素，培养1～2天，继续加入终浓度为1～5ug/ml的卡那 霉素，再培养2天；

以上所述方法中，优选的氨苄青霉素的终浓度为300ug/ml，培养2天后，继续加入终 浓度为5ug/ml的庆大霉素，培养2天，继续加入终浓度为5ug/ml的卡那霉素，再培养2 天。

2).将雨生红球藻厚壁孢子液和甘油按体积比为1:1进行混合，使得混合液中细胞密 度的终浓度为1.5×10⁵～5×10⁵个/ml，甘油的终浓度为5～25％(体积比)室温静置5～20mi n，然后放入程序降温仪中，0.5℃/min～5℃/min，预冻至-30℃～-80℃，在此温度保持30 min～120min，然后放入液氮罐中保存。

以上所述方法中，优选的：

甘油的终浓度为5％～15％；降温速率为0.5℃/min～2℃/min，预冻至-30℃～-60℃， 在此温度保持30min～60min。

以上所述方法中，优选的：

甘油的终浓度为15％；混合液中细胞密度的终浓度为5×10⁵个/ml；降温速率为1℃/mi n，预冻至-40℃，保持30min。