[发明专利]一种利用线粒体D-loop区特异区域鉴定鼋的标记引物及方法

说明书

本发明提供了一种利用线粒体D‑loop区特异区域鉴定鼋的标记引物，为以下引物组：D1F：5’‑ATTAATTCATGCTTGTAGGAC‑3’，D1R：5’‑CGGGGTAGGGGGTTTAG‑3’。本发明还提供了利用线粒体D‑loop区特异区域鉴定鼋的方法，采用所述引物组对待测样本的全基因组DNA进行PCR扩增，然后进行电泳，如能够获得两条鼋特异性多态性片段的条带，即判断待测样品的物种是鼋，反之则获得相反结果。

技术领域

本发明涉及一种利用线粒体D-loop区特异区域鉴定鼋的标记引物及方法。

背景技术

鼋（Pelochelys cantorii）是鼋属仅有的三个种之一，又被称为“水中大熊猫”。鼋生活在淡水中，是鳖科中体型最大的一种。鼋广泛分布在东南亚各国，中国南部，印度和巴基斯坦的海岸。然而，因为捕猎，栖息地的破坏以及环境的污染，鼋的分布范围和数量急剧减少。在1996年，鼋被列入世界自然保护联盟 (IUCN)世界濒危动物红色名录易危种，并在2000年提升为濒危种。因为鼋极度濒危的状态，中国也将它列为一级保护动物。

鼋的稀少使得人们缺少对它的了解，形态特征无法单独作为精确判断的标准，鉴定方法不够准确。鼋和鳖在幼体阶段非常相似，野外的个体得不到有效保护。因为没有专业知识，人们有时会错误的将野外捕到的成鼋当作野生大鳖售卖。这种问题进一步加重了鼋种质资源的减少，从而影响了保护措施的有效性。

线粒体基因组是16-18kb大小的环状DNA，编码13个蛋白，22个tRNA，2个rRNA。线粒体DNA具有结构简单，高突变率，缺少基因重组以及严格的母性遗传的特性。因为这种特点，线粒体DNA被广泛的用于物种鉴定，系统进化，种群多样性等方面的研究。

发明内容

本发明目的之一是提供一种利用线粒体D-loop区特异区域鉴定鼋的标记引物。

本发明采用以下技术方案来实现本发明的目的：一种利用线粒体D-loop区特异区域鉴定鼋的标记引物，为以下引物组：

D1F：5’-ATTAATTCATGCTTGTAGGAC-3’

D1R：5’-CGGGGTAGGGGGTTTAG-3’。

线粒体DNA(mtDNA)控制区，又称D-loop区，是一段非编码区，通常位于tRNAPro和tRNAPhe基因之间。结构较为复杂，分为3个区段：终止序列区、中央保守区和保守序列区。由于缺乏编码的压力，控制区的进化速度相对较快，其序列的变异不仅有核苷酸之间的替换，还有不同长度核苷酸序列的缺失、插入或不同拷贝数的串联重复，是线粒体DNA序列和长度变异最大的区域，常用于种内的遗传多样性，进化分析等。尽管mtDNA变异率高，但也存在一些保守序列，这些保守序列可以承担标记基因的作用。本发明人采用广东省的高明和肇庆广宁的死亡的幼鼋样本提取线粒体DNA与NCBI上厦门鼋和永嘉鼋的线粒体DNA对比，发现鼋的线粒体DNA控制区存在重复片段的特殊结构，而该特殊结构在目前已知的龟鳖物种中均没有发现。可见，线粒体DNA控制区序列在种内几乎是相同的，在种间的差异很大，可用于种间鉴别。因而，本发明根据所述特殊结构设计特异性引物用来实现对鼋的鉴定。本发明人还采用多个鼋个体进行验证，排除了由于单个个体突变所产生特殊结构的可能性，保证了引物应用的广泛性和可靠性。发明人针对鼋的线粒体DNA控制区存在的重复片段设计引物对，并验证所涉及引物的特异性。图1中虚线标注的地方为上游引物的设计位置，实线标注的地方是下游引物的设计位置，而各引物组扩增的预期片段大小见表1。经过验证，设计的D1引物对特异性最强。

本发明的目的之二为提供一种鉴定鼋的方法。具体为，一种利用线粒体D-loop区特异区域鉴定鼋的方法，采用上述引物组对待测样本的全基因组DNA进行PCR扩增，然后进行电泳，如能够获得两条鼋特异性多态性片段的条带，即判断待测样品的物种是鼋，反之则获得相反结果。