[发明专利]一种提高牙鲆有丝分裂雌核发育双单倍体诱导效率的方法

说明书

技术领域

本发明属于水产生物技术技术领域，具体涉及一种提高牙鲆有丝分裂雌核发育双单倍体诱导效率的方法。

背景技术

有丝分裂雌核发育是一种用射线灭活的精子激活卵子，再在特定时期对卵子施以物理或化学方法抑制其卵裂的特殊生殖方式。通过诱导有丝分裂雌核发育所获得的个体称为双单倍体，具有基因组完全纯合的特点。双单倍体是极为珍贵的育种基础材料，基于双单倍体可快速建立纯合克隆系和杂合克隆系。无论纯合克隆系或杂合克隆系，都是进行数量性状定位、功能基因挖掘以及全基因组测序的最佳材料。模拟实验显示，利用双单倍体进行全基因组范围的QTL定位，具有比其他交配模式更好的检测能力。

在作物上，基于双单倍体所形成的克隆系因其系内整齐一致、无杂合位点等特点，无论在育种实践还是基础研究中，与经过多代连续自交而产生的系相比具有一定的优越性。这也成为北美和欧洲商业化育种主要的选系方法。

在鱼类上，基于双单倍体的育种研究一直进展缓慢。虽然在一些鱼类上成功的诱导了双单倍体及克隆系。这个和作物上有较大的差距。究其原因，双单倍体的低诱导效率和低成活率是众多潜在原因中最为重要的两个。这大大的制约了鱼类育种中双单倍体技术的应用。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种提高牙鲆有丝分裂雌核发育双单倍体诱导效率的方法。本发明通过对诱导有丝分裂雌核发育双单倍体前，先对所用母本的纯合度进行鉴定，筛选出纯合度高的亲本，再进行诱导，从而提高了诱导效率。

本发明所采用的技术方案为：一种提高牙鲆有丝分裂雌核发育双单倍体诱导效率的方法，在进行有丝分裂雌核发育诱导之前，先进行纯合度的鉴定和筛选：使用微卫星标记对母本进行纯合度的鉴定，并筛选母本进行双单倍体的雌核发育诱导。

在本发明中，筛选纯合度大于0.2000的母本进行双单倍体的雌核发育诱导。

优选地，利用覆盖牙鲆24个染色体的24个微卫星标记对雌性亲鱼的纯合度进行鉴定。

本发明中，所使用的微卫星标记，为覆盖牙鲆24个连锁群(对应牙鲆24条染色体)的24个高重组率微卫星标记，使用所述微卫星标记对雌性亲鱼的纯合度进行鉴定，能够得到更为全面的牙鲆纯合度数据。

所述微卫星标记的重组率均大于0.667。所述重组率是根据所述微卫星标记与着丝粒之间在第一次减数分裂四分体时期发生交换频率的高低来计算的。理论上来说，如果不存在交叉干涉，微卫星标记与着丝粒之间的重组率最大为0.667。重组率越高，代表发生交换的频率越高。

连锁群序号和对应的微卫星标记的信息见表1

表1：微卫星标记信息表

按照上表从上到下的顺序，发明人提供了符合《专利法》规定的序列表，序列表的编号从SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：48。

优选地，所述提高牙鲆有丝分裂雌核发育双单倍体诱导效率的方法，包括以下步骤：

A、纯合度的鉴定和筛选；

B、精子和卵子的采集：采集牙鲆雌鱼卵子和雄性真鲷精子；

C、精子灭活：用Ringer’s液对精子进行稀释，随后用紫外线进行照射灭活；

D、人工授精：将卵子和灭活后的精子混匀，并激活孵化；

E、诱导双单倍体：孵化完成后，对步骤D中得到的精卵混合物进行静水压处理，处理结束后，将卵子转移至孵化缸孵化。

在进行传统的有丝分裂雌核发育诱导之前，筛选纯合度高的母本，能够得到更高的诱导效率，即更高的孵化率和更低的畸形率；在诱导孵化完成之后，对获得的后代进行纯合度检验，以验证诱导有丝分裂雌核发育的效果。

Ringer’s液又被称为林格氏液，一种与哺乳动物的血液和淋巴大致等渗的盐溶液，Ringer’s液被广泛应用于组织、细胞和一些低等动物培养或保存。本发明中，林格氏液为海水鱼用林格氏液。