[发明专利]一种转异戊烯基酰基转移酶基因玉米育种方法

权利要求书

1.一种转异戊烯基酰基转移酶基因玉米育种方法，其特征在于：包括ZmIPT2基因的克 隆和植物表达载体构建、ZmIPT2基因对玉米的遗传转化和转ZmIPT2基因后代的功能检测；

所述ZmIPT2基因的克隆和植物表达载体构建：试验材料为：章鱼碱型农杆菌菌株 LBA4404，基础植物表达载体为pCAMBIA5300，启动子为Ubiquitin，终止子为T-nos，CaMV35S 启动子驱动Epsps基因作为选择标记；

A：基础植物表达载体的线性化：用限制性内切酶SmaI酶切载体pCAMBIA5300-Ubi- EPSPS，冰板操作上，取200ulPCR管，加入2ul基础载体pCAMBIA5300-Ubi-EPSPS、2ul10× buffer酶切缓冲液、限制性内切酶0.5ul、1ulBSA，轻轻混合均匀，37°C反应1h，65°C终止，胶 回收试剂盒方法回收上述酶切线性载体；

B：ZmIPT2基因片段克隆：根据In-Fusion技术原理设计克隆引物，在ZmIPT2基因序列的 上下游引物的外侧，分别引入经SmaI线性化的pCAMBIA5300-Ubi-EPSPS载体两端各15个碱 基，使克隆引物外侧的15个碱基与线性化载体两端的15个碱基序列同源，用植物RNA提取试 剂盒，从玉米自交系K10叶片中提取总RNA进行RT-PCR反应逆转录得到cDNA序列，用带有 smaI酶切位点引物PCR扩增，

引物序列为：

I-G-4-R：5’-attcgagctcggtacccgggATGGAGCACGGTGCCGTCGC-3’

I-G-4-F：5’-GACTCTAGAGGATCCCCGGGTCATGCATCAGCCACGGCGGTGA-3’

20mlPCR体系：

无菌水13.5ul

10×trantaqBufferI(Mg²⁺)2ul2.5mM/L

I-Q-1-R0.5ul(10pM)

I-Q-1-F0.5ul(10pM)

dNTP2ul(200uM/L)

质粒1ul约1ug

高保真Tad酶0.5ul(2U)

反应程序：94℃预变性4min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，30cycle， 72℃延伸10min，8℃终止反应，1%琼脂糖凝胶电泳；

回收PCR产物片段，进行TA克隆、蓝白斑筛选，选取阳性克隆送上海生工测序；测序结果 和原序列进行比对；

ZmIPT2基因cDNA测序引物序列：

I-Q-1-R:ATGGAGCACGGTGCCGTCGC

I-Q-1-F:TCATGCATCAGCCACGGCGGTGA

C：植物表达载体构建与验证：根据上部试验克隆的目的基因片段，将目标基因片段与 酶切线性载体以摩尔比2:1混合到10μL去离子水中，再加入到含有In-Fusion酶的离心管 中混匀，PCR仪控制温度37℃15min，50℃15min，12℃放置10min，后转移到冰上，取2μL上 述连接产物50ul大肠杆菌5α感受态细胞，冰浴30min，42℃热激30s，之后37℃活化菌体1h， 均匀涂在含抗生素AMP⁺的LB固体培养基平板培养，挑取平板上单菌落，37℃LB液体培养 基培养12h，TransGen质粒提取试剂盒提取质粒，进行载体单酶切验证smaI单酶切验证，之 后电泳对比构建前后载体大小变化情况，最后送至由上海生工生物工程有限公司测序；与 Genebank库中的cDNA测序比对后导入农杆菌5α感受态-80°C保存；

D：农杆菌感受态制备与转化：挑取农杆菌菌落于2mlYEP液体（rif20mg/ml）培养基 中，150rpm/min温度28℃摇床过夜活化，取2ml过夜活化菌液接种于50mlYEP液体培养基中 150rpm/min，28℃培养生长至OD₆₀₀≈0.5，吸取2ml菌液5000rpm离心5分钟，在2ml0.2mmol 预冷的CaCl₂溶液涡旋感受态细胞；按200ul分装到1.5mlEp管中，储存于-80℃待用，将5ul 目的基因质粒(约1ug)加于200ul感受态细胞中，冰上放置30min；液氮中冷冻5min,后迅速 置37℃水浴中热激5min感受态细胞；在无菌工作台上加入1mlYEP培养基活化菌体，之后 150rpm/min，28℃摇床培养4h，将活化后的菌体4000rpm/min离心1min，去掉上清液，无菌工 作台中加入100ulYEP液体培养基涡旋细胞；涂上含Kan（50mg/ml）的YEP固体培养基平板 上，28℃恒温培养2-3天；

所述ZmIPT2基因对玉米的遗传转化：实验材料：玉米杂交种HiII，具体方法如下：

（1）工程菌液制备：活化的农杆菌平板，挑取单克隆，300ulYEP液体培养基稀释后，农杆 菌在含卡那霉素（Kan）50mg/L、利福平（rif）50mg/L的YEP培养基上19℃培养3天；

（2）农杆菌侵染玉米幼胚：农杆菌液5ml的液体侵染培养基中加入AS终浓度100uM；幼胚 放入侵染培养基，AS终浓度100uM；另从平板中挑取单菌落EHA105(携带质粒pCAMBIA-5300) 接种到5mLYEB液体培养基中，28°C，220r/min振荡培养至对数生长期成为农杆菌悬浮 液（OD₅₅₀=0.6-0.7），加入幼胚在悬浊液中，静止5min；侵染后吸出菌液，将幼胚转移到共培 养基表面，幼胚盾片向上放置；封口膜密封培养皿，20℃暗培养三天；经过三天共培养，胚转 移到恢复培养基上，在28oC的暗培养7天；转移从共培养基到恢复培养基；幼胚28oC暗培养7 天，转移至筛选培养基I，含1.5mg/L草甘膦培养2周；两个星期以后，移至筛选培养基II，草 甘膦增加到3mg/L，侵染五周后，产生II型愈伤，将II型胚性抗性愈伤组织在再生培养基I 上暗培养三个星期完成成熟出苗，植株长至4-6厘米，根系充分发育，转移至土壤基质中，放 在培养室中26摄氏度/22摄氏度（白天/晚上）16小时光照，8小时黑暗，二周后，挑选生长状 态较好的幼苗，移栽入含有营养土：蛭石：大田土=1：1：1的大花盆中，定期浇水直至结实；

（3）PCR检测

Epsps基因引物：

Epsps-6-R：5’-ACATCGAAGTCATCAACCCG-3’

Epsps-6-F：5’-GAATTCGAGCTCATCAGGCA-3’

ZmIPT2基因引物:

I-T-1-R:5'AGATGGTGAGGGCTTTCC3'

I-T-1-F:5'GCGCGCTATATTTTGTTT3'

20mlPCR体系：

无菌水13.5ul

10×trantaqBufferI(Mg²⁺)2ul2.5mM/L

上游引物0.5ul(10pM)

下游引物0.5ul(10pM)

dNTP2ul(200uM/L)

质粒1ul约1ug

Tad酶0.5ul（2U）

PCR反应条件：94℃，5min；94℃，30sec；56℃，30sec；72℃1min；33个循环；72℃， 10min；8℃终止反应；反应完取3ml与2ulLoadingbuffer琼脂糖凝胶电泳检测；

RT-PCR检测：

（1）植物RNA的提取

取转基因玉米植株新鲜片叶期的幼嫩叶片，置于干净研钵研磨成细粉，操作步骤按照 北京全试金试剂公司RNA提取试剂盒说明书进行；采用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA，紫外分 光光度计检测RNA浓度；之后-80°C保存；

（2）cDNA的合成

取2μLRNA为模板，用Fermentas^?公司反转录试剂盒；

冰板上操作，在200mlPCR管中加入检测质量好的200ng玉米总RNA、1ulAnchored oligo(dT)₁₈、11.5ulRNase-freeWater，轻轻混回65°C孵育5min，冰上放置2min；

加入1ul10mMdNTPs，4ul5×ESRTBuffer，0.5ulRibonucleaseInhibitor(50 units/ul)，1ulEasyScript^?RT，轻轻混匀，42°C孵育30min，85°C5s使EasyScript^?RT酶 失活；合成第一条cDNA；

（3）PCR扩增

根据基因序列设计引物，扩增片段长度为522bp，以总RNA合成的cDNA为模板进行PCR扩 增；

Epsps基因引物：

E-r-1-R：5’-GGCGACAGCGAGAATC-3’

E-r-1-F：5’-GGTGAAATCGGAAGACG-3’

20mlPCR体系：

无菌水13.5ul

10×trantaqBufferI(Mg²⁺)2ul2.5mM/L

E-r-1-R0.5ul(10pM)

E-r-1-F0.5ul(10pM)

dNTP2ul2ul(200uM/L)

质粒1ul约1ug

高保真Tad酶0.5ul(2U)

PCR反应程序：

94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，72℃延伸10 min，4℃终止反应，30个循环，PCR反应结束后，取5μL混合液加入1ulLoadingbuffer， 在1%琼脂糖凝胶电泳；

所述转ZmIPT2基因后代的功能检测：实验材料：转ZmIPT2基因T2代3个株系I143、I146、 I150，方法如下：

叶绿素含量检测：

（1）玉米抽雄期开始每隔7天取转基因玉米灌浆期新鲜玉米叶片，剪碎加入丙酮与无水 乙醇2:1的混合溶液中，浸泡至叶片完全脱色为止；

（2）将提取液倒入石英比色皿中，在分光光度计663nm和645nm处分别测定叶绿素a和叶 绿素b值；计算公式如下：

叶绿素a的含量=（12.7A₆₆₃-2.69A₆₄₅）V/1000*W

叶绿素B的含量=（22.7A₆₆₃-4.68A₆₄₅）V/1000*W

叶绿素总含量=（20.2A₆₆₃+8.02A₆₄₅）V/1000*W

A_663：、A₆₄₅分别为相应波长时的吸光度，V为提取液体积，W为叶片鲜重；所测叶绿素单位 为mg/gFW；

CTK含量检测：液氮取玉米抽雄期开始每隔7天取转基因玉米灌浆期新鲜玉米叶片，准 确称重0.5g；浴加入80%甲醇1ml溶液研磨叶片成匀浆装入10ml离心管；4°C提取4小时， 8000r/15min离心，吸取上清至新10ml离心管中，再原管中加入1ml80%甲醇ml，混合均匀， 继续4°C提取1小时；4°C8000r/15min离心；再浸提1次；合并三次提取上清液，4°C8000r/ 10min离心除去底部残渣，加入等体积石油醚，混合均匀，待分层后去除绿色的石油醚相；甲 醇相样品氮气吹干浓缩加入50ul样品稀释液；测定方法见试剂盒：

（1）标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品稀释5个梯度48μg/L、24μg/L、12μg/L、 6ug/L、3μg/L和空白孔；

（2）加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准 孔、待测样品孔；在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μ l，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）；加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不 触及孔壁，轻轻晃动混匀；

（3）温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；

（4）配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用；

（5）洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，重复5 次，拍干；

（6）加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；

（7）温育：操作同3；

（8）洗涤：操作同5；

（9）显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15分钟；

（10）终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）；

（11）测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）；测定应在加终 止液后15分钟以内进行；计算以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出 标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的 浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓 度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。