[发明专利]一种转异戊烯基酰基转移酶基因玉米育种方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种玉米育种方法，尤其涉及一种转异戊烯基酰基转移酶基因玉米育 种方法。

背景技术

衰老是植物自身发育的降解或再活化的过程，在植物不断的生长与发育的过程中 积累，衰老过程中，同化能力减弱或丧失，营养物质大量流失至新的组织器官中，当处在不 利的环境条件下，如各种生物或非生物胁迫，可能会引起植物过早地衰老，缩短植物生命， 而降低作物产量。衰老是一个受外部和内部各种因素影响的过程，也是一个植物内部精细 调控的过程。影响叶片衰老的外部因素包括光照、温度、干旱、营养物质、非生物等原因，内 部因素包括基因调控、内源或外源植物激素、年龄等。

作物物种提供用于人类消费或为生产生物能源和其他用途的成熟或近成熟的果 实或种子，植物发育的最后阶段涉及全株衰老过程，其中从营养植物部分的矿物元素，营养 物质转移到成熟果实或贮藏器官。这种类型的衰老的是一个整体植物被称为一次果衰老与 树木衰老和灌木不同，农作物是这种衰老类型。多年来关于作物植物产量和衰老之间的关 系的假说有很多，Thomas认为，延长最大光合活性的一段时间，即延迟衰老，应得到更高的 产量。叶面积和产量之间的正相关性应该适用于对大多数农作物对于总生物量生产和块茎 作物，这种关系相对于要求种子产量的作物，两者之间关系更加复杂，特别是谷类作物。谷 物产量是由库(即籽粒发育)和源(即光合作用营养组织)决定的。当前的主要看法是，库容 大小是产量的主要限制因素，尤其是在小麦谷物如小麦。尤其是在结实期时，是决定产量的 水平是至关重要。尽管对于小麦籽粒产量只稍受籽粒灌浆过程在源活性的改变影响，而在 玉米产量似乎取决于维护源的高活性，即在保持在光合组织不受影响，两中作物似乎在有 关于在灌浆期源库关系与产量上有很大不同，而叶片过早的衰老都会影响两者产量。尽管 源库关系是决定产量形成的基本结构，但在作物生长后期，若叶片过早衰弱，光合速率减 弱，直接导致库强源不足，从而影响作物产量。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种转异戊烯基酰基转移酶基因 玉米育种方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明包括ZmIPT2基因的克隆和植物表达载体构建、ZmIPT2基因对玉米的遗传转 化和转ZmIPT2基因后代的功能检测；

所述ZmIPT2基因的克隆和植物表达载体构建：试验材料为：章鱼碱型农杆菌菌株 LBA4404，基础植物表达载体为pCAMBIA5300，启动子为Ubiquitin，终止子为T-nos，CaMV35S 启动子驱动Epsps基因作为选择标记；

A：基础植物表达载体的线性化：用限制性内切酶SmaI酶切载体pCAMBIA5300-Ubi- EPSPS，冰板操作上，取200ulPCR管，加入2ul基础载体pCAMBIA5300-Ubi-EPSPS、2ul10× buffer酶切缓冲液、限制性内切酶0.5ul、1ulBSA，轻轻混合均匀，37℃反应1h，65℃终止，胶 回收试剂盒方法回收上述酶切线性载体；

B：ZmIPT2基因片段克隆：根据In-Fusion技术原理设计克隆引物，在ZmIPT2基因序 列的上下游引物的外侧，分别引入经SmaI线性化的pCAMBIA5300-Ubi-EPSPS载体两端各15 个碱基，使克隆引物外侧的15个碱基与线性化载体两端的15个碱基序列同源，用植物RNA提 取试剂盒，从玉米自交系K10叶片中提取总RNA进行RT-PCR反应逆转录得到cDNA序列，用带 有smaI酶切位点引物PCR扩增，

引物序列为：

I-G-4-R：5’-ATTCGAGCTCGGTACCCGGGATGGAGCACGGTGCCGTCGC-3’

I-G-4-F：5’-GACTCTAGAGGATCCCCGGGTCATGCATCAGCCACGGCGGTGA-3’

20mlPCR体系：

反应程序：94℃预变性4min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，30cycle， 72℃延伸10min，8℃终止反应，1％琼脂糖凝胶电泳；

回收PCR产物片段，进行TA克隆、蓝白斑筛选，选取阳性克隆送上海生工测序；测序 结果和原序列进行比对；

ZmIPT2基因cDNA测序引物序列：