[发明专利]一种与牙鲆生长性状相关的SNP位点、其筛选方法及应用

权利要求书

1.一种引物组合物在筛选与牙鲆生长性状相关的SNP标记中的应用，其特征在于，所述的SNP标记的序列如SEQ ID NO：1所示，所述SEQ ID NO：1的GH基因中第4个内含子第33bp位置的碱基为A，所述引物组合物包括上游引物的序列如SEQ ID NO：2所示；下游引物的序列如SEQ ID NO：3所示和延伸引物的序列如SEQ ID NO：4所示。

2.一种筛选牙鲆的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.牙鲆筛选：根据GB/18654.3-2008中的生长性状指标为标准，筛选得到不同的牙鲆，生长性状指标包括但不限于全长、体长和体高；将筛选的牙鲆分别经过诱导得到不同的雌核发育家系和/或杂合克隆家系，并对每个雌核发育家系和/或杂合克隆家系进行荧光标记；

B.同池混养：将筛选后的牙鲆在同池中混养；

C.基因分型：一定的养殖周期后，对不同牙鲆的GH基因中权利要求1中所述SNP标记进行鉴定；

在所述SNP标记筛选前，先对所述GH基因进行PCR扩增，使用的上游引物的序列如SEQID NO：2所示；下游引物的序列如SEQ ID NO：3所示；

对每条牙鲆的GH基因进行PCR扩增后，对PCR产物使用SNaPshot SNP分型方法对牙鲆的GH基因进行鉴定，SNaPshot SNP分型方法中所用的延伸引物的序列如SEQ ID NO：4所示；延伸反应体系为：总体积为6μL，PCR产物2μL，Snapshot Mix试剂1μL，延伸引物0.3μL，余量为水；延伸程序为：在96℃温度下变性1min，然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：96℃温度下变性10s，在52℃温度下复性5s，在60℃温度下延伸30s；延伸程序结束后，使用测序仪对延伸产物进行测序；

同时根据GB/18654.3-2008标准，测得不同牙鲆的生长性状指标；

D.关联分析：对不同牙鲆的生长性状指标与其SNP标记的基因型进行关联分析。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述基因分型步骤中，PCR扩增反应体系为：总体积为15μL，DNA 1μL、10×buffer 1.5μL、Mg²⁺1.5μL、dNTP 0.3μL、引物0.3μL/条、Taq酶0.3μL、余量为水；使用的PCR扩增程序为：在94℃温度下预变性3min；然后进行35个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性15s，在56℃温度下复性15s，在72℃温度下延伸30s；完成35个循环之后，在72℃的温度下延伸3min。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述基因分型步骤中，PCR循环结束后，进行纯化步骤，再将纯化后的PCR产物进行SNaPshot SNP分型方法处理；所述纯化步骤为：取3μL PCR产物用ExoI和FastAP纯化，纯化反应体系为：总体积7μL，PCR产物3μL，ExoI 0.2μL，FastAP 0.8μL，ExoI buffer 0.7μL，余量为水；纯化过程为：在37℃温度下保持15min后，在80℃温度下保持15min。