[发明专利]水蜜桃果实ICE1基因、其克隆方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及涉及一种水蜜桃果实ICE1基因、其克隆方法及应用。

背景技术

ICE1（inducerofCBFexpression1）是植物低温响应基因中最上游的一个转录 因子。它在低温时特定地结合到CBF3基因的启动子序列上，诱导CBF3的表达，而后CBF3结合 到其下游目的基因启动子的DRE序列上，诱导下游一系列冷诱导基因COR以及在植物寒冷适 应中起作用的其他基因的表达，从而提高植株的抗寒性。水蜜桃属于典型的呼吸跃变型水 果，不易保鲜，在低温运输、贮藏过程中易发生冷害。冷害不仅影响果实的商品价值，而且会 加剧升温后的腐烂、品质劣变，进而影响果实的货架期。目前，还未见水蜜桃ICE1基因功能 的报道。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种水蜜桃ICE1基因。

本发明的目的之二在于提供该基因的克隆方法。

本发明的目的之三在于提供该基因在农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥中的 应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案如下：

一种水蜜桃果实ICE1基因，其特征在于该基因为SEQIDNO.1所示的碱基序列。

一种上述的水蜜桃果实ICE1基因的编码蛋白，其特征在于该编码蛋白为SEQID NO.1所示的碱基序列的氨基酸序列。

一种载体，其特征在于该载体含有上述的水蜜桃果实ICE1基因。

一种重组质粒，其特征在于该质粒含有上述的载体。

一种上述的水蜜桃果实ICE1基因的克隆方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.以苹果ICE1，即ABS50251为探针，在NCBI中对桃基因组数据库进行BLAST搜索，检索 出一条具有完整开放阅读框的核甘酸序列XM_007209914，即为预测的桃ICE1基因序列；

b.提取水蜜桃果实总RNA，然后反转录获取cDNA第一链;根据预测的桃ICE1序列XM_ 007209914设计扩增ICE1基因的上游引物S1和下游引物S2；再以所述反转录获得的cDNA为 模板，进行聚合酶链式PCR反应，即得到水蜜桃果实ICE1基因；

所述的上游引物S1为：5’-TGGGCTCTCTGTCTACCT-3’；

所述的下游引物S2：5’-ACGACTCCCGTCTTTGGT-3’。

上述的PCR反应的反应体系为：2×高保真PCRMix15μL，模板1μL，上下游引物各1μ L，加ddH₂O至30μL；所述的PCR反应的反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，47℃退火 30s，68℃延伸3min，35个循环；68℃再延伸10min。

一种根据上述的水蜜桃果实ICE1基因在农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥中 的应用。

以反转录获取的cDNA为模板，用即用型高保真PCR试剂盒进行扩增反应，产物与 PGM-T载体构建重组质粒，转化TOP10感受态细胞并进行测序。测序结果与预测的桃ICE1序 列（XM_007209914）一致性为99.72％。对测序序列所编码的氨基酸序列进行结构域分析，发 现其拥有一个bHLH区域（含44个氨基酸残基），这个区域的氨基酸序列同苹果ICE1的bHLH结 构域高度保守。可见，该测序序列即为水蜜桃果实ICE1基因序列，该序列已提交BanKit（登 录号为KT148884）。

根据水蜜桃果实ICE1基因序列设计扩增其开放阅读框序列的上、下游引物（分别 引入酶切位点KpnⅠ和BamHⅠ序列）。ICE1基因开放阅读框，基因序列为：SEQIDNO.5。扩增构 建正义表达载体的ICE1序列引物为：上游引物ICE1-KpnⅠ：SEQIDNO.6；下游引物ICE1- BamHⅠ：SEQIDNO.7。扩增构建反义表达载体的ICE1序列引物为：上游引物ICE1-BamHⅠ：SEQ IDNO.8；下游引物ICE1-KpnⅠ：SEQIDNO.9。

以测序菌样为模板，用即用型高保真PCR试剂盒扩增水蜜桃果实ICE1基因的开放 阅读框序列。产物与PGM-T载体构建重组质粒，转化TOP10感受态细胞，再次进行序列测序。 测序结果与首次测序结果同源性为100％。

1.正义、反义植物表达载体PCAMBIAy1300-ICE1的构建