[发明专利]一种提高棘白菌素B产量的方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种提高阿尼芬净前体化合物EchinocandinB产量的培养方法。

(二)背景技术

棘白菌素B(EchinocandinB)是一种具有环状六肽核心和脂肪酸侧链结构天然环状脂肽类化合物。化学名是，分子式为C₅₂H₈₁N₇O₁₆，分子量为1060，结构式如下：

棘白菌素(Echinocandin)类抗生素是20世纪70年代发现的一组天然产物，具有类似的环状多肽核心和不同的脂肪酸侧链的结构特征，能够非竞争性地抑制真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶的活性，从而达到抗真菌的目的。阿尼芬净(Anidulafungin)是继卡泊芬净(Caspofungin)、米卡芬净(Micafungin)之后的第三代全身抗真菌类棘白菌素衍生物药物，2006年2月21日，由辉瑞公司生产的阿尼芬净通过了美国FDA认证，主要治疗念珠菌血症和其他形式的念珠菌感染(腹腔脓肿、腹膜炎)和食管念珠菌等。阿尼芬净是由前体化合物棘白菌素B经犹他游动放线菌脱酰基酶脱去侧链亚油酰基，然后在DMF中与活性中间体4-戊氧基-[1,1',4',1]三苯基-4-甲酸-2,4,5-三氯-苯基酯反应制得。

目前国内外棘白菌素(Echinocandin)类抗生素前体均是利用微生物发酵法进行制备，其中棘白菌素B由构巢曲霉(Aspergillusnidulans)的发酵获得。目前关于棘白菌素B发酵的文献报道较少，相关文献大多集中于卡泊芬净及米卡芬净的前体化合物发酵。MariaPapagianni等人综述了棘白菌素B发酵过程中的接种量、碳氮源种类及浓度、pH、温度及搅拌速率等因素对构巢曲霉生长的影响，表明中性pH有利于菌体生长和孢子形成，且其比生长速率会随温度的升高而升高，但是温度升高后菌体出现失水加剧的后果，最终会导致目标化合物的合成量降低。FritzBenz等学者通过红外、核磁共振等方法确定了棘白菌素B的分子结构，且发现其水解成分中包括了亚油酸、4-羟基-L-脯氨酸、4-羰基-L-脯氨酸、L-苏氨酸、(2S,3S,4S)-4-甲基-3-羟脯氨酸等。Petersen等人考察了不同金属离子添加对PneumocandinB0发酵的影响，发现培养基中添加锌离子、铜离子、钴离子和镍离子均对PneumocandinB0合成产生抑制作用，其中锌离子和钴离子抑制作用最显著。Petersen等人还考察了脯氨酸的添加对PneumocandinB₀的影响，发现当培养基中不添加脯氨酸时，其效价仅为274mg/L，当添加10g/L脯氨酸后其效价提高至494mg/L；国内刘靓等人也发现在培养基中添加3g/L的脯氨酸能够有效地提高PneumocandinB₀在发酵产物中的比例。

目前主要问题是国内棘白菌素B的发酵制备水平较低，因此利用发酵代谢调控手段对发酵过程进行优化，提高棘白菌素B产量，对于阿尼芬净的工业化生产来说具有极其重要的意义。本发明旨在通过金属离子来对构巢曲霉的代谢进行调控以实现棘白菌素B产量的提高，为后续的大规模发酵奠定基础。

(三)发明内容

本发明目的在于针对现有的棘白菌素B发酵产量低的缺陷，提供一种通过添加金属离子提高棘白菌素B发酵水平的技术。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种提高棘白菌素B产量的方法，所述方法为：以构巢曲霉CCTCCM2012300为生产菌株，将构巢曲霉CCTCCM2012300接种至添加有金属离子的发酵培养基中，在20～30℃、220～280rpm下培养7～12天，得到红褐色的发酵液，发酵液经分离纯化得到棘白菌素B；所述发酵培养基质量终浓度组成为：甘油0.5～5％，蛋白胨0.5～5％，L-脯氨酸0.1～0.5％，甘露醇1～10％，黄豆饼粉1～10％，鸟氨酸0.1～0.5％，花生油0.5～5％，K₂HPO₄·3H₂O0.2～2％，溶剂为蒸馏水，pH值自然；所述金属离子添加终浓度为50～2000mg/L发酵培养基，优选50～600mg/L，更优选500～600mg/L。

进一步，所述金属离子为锰、亚铁、钙、铜或镁中的一种或多种，所述金属离子以氯化盐或硫酸盐的形式加入，更优选氯化钙、氯化亚铁、硫酸锰、硫酸铜或硫酸镁。