[发明专利]一种检测基因工程酶活力的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物学领域，具体涉及基因工程技术领域。

背景技术

现有技术的报告基因分析技术，如蓝白斑筛选和抗生素筛选，在分子生物学领域有广泛应用。

蓝白斑筛选(β-半乳糖苷酶系统)是分子生物学实验中较常用的筛选标记，具有高效和简单的优势，主要用于基础研究，包括提高克隆效率。近年来，蓝白斑筛选用于体细胞突变的体外基础研究，后者如big-blue小鼠和大鼠(ref)；以及用于人类遗传性突变的基因分析。但蓝白斑筛选技术用于人类KRAS基因突变，还是一种有待研发的新技术。

在离体研究中，此类载体携带lacZ基因，它编码β-半乳糖苷酶的N-末端(α-肽)，并且处于诱导物IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，与乳糖结构类似但不能被β-半乳糖苷酶降解)诱导的启动子调控之下。质粒转化的宿主菌为LacZ△M15基因型(含有编码N-末端缺陷型的β-半乳糖苷酶多肽的基因)。未重组的质粒转化宿主菌后，在IPTG的诱导下，质粒与宿主菌分别表达缺陷但可以相互补偿的两个肽(即α-互补)，形成了有功能的β-半乳糖苷酶，该酶能把培养基中无色的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)底物分解成半乳糖和深蓝色的5-溴-4-氯-靛蓝，菌落呈现蓝色。但当外源DNA插入质粒位于α-肽编码序列中的多克隆位点时，由于破坏了α-肽的阅读框架，使其编码的α-肽失去活性，则重组子所在的细菌不能完成α互补，不能形成有活性的β-半乳糖苷酶，致使重组菌形成白色菌落。因此，可以借助蓝白斑筛选出重组子。本发明由此而来。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可以在大肠杆菌上检测基因工程核酸酶有无活性及活性高低的方法。本发明通过构建含有双重复片段的待测靶序列载体，与基因工程酶进行共转化，利用双转化后所产生的菌落变化，对核酸酶活性进行评估。

本发明的技术核心为待测靶序列两端含有双拷贝的完全相同重复序列的载体。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种检测基因工程核酸酶活力的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)选取含有携带lacZ基因的载体，

(2)构建含有双重复片段的载体：将两个重复片段插入到所述的载体中，且将待测核酸酶的靶序列插入两个重复片段之间，所述的两个重复片段的序列完全一致，且所述的两个重复片段为移动报告基因的阅读框架；

(3)将步骤(2)构建的含有基因工程核酸酶与双重复片段的载体进行在含有X-Gal-IPTG的培养基中进行转化，

(4)根据共转化的菌落形成结果对酶活力进行评价。

本发明优选的一技术方案中，所述载体包含但不限为PMD19-T、PMD18-T、CRISPR/Cas9。

本发明优选的一技术方案中，所述重复片段的长度为10到50个碱基。

本发明优选的一技术方案中，所述重复片段包括EGFR重复片段，其核苷酸序列如SeqIDNo.1所示；HBV重复片段，其核苷酸序列如SeqIDNo.2所示；LoxP重复片段，其核苷酸序列如SeqIDNo.3所示。

本发明优选的一技术方案中，所述步骤(4)中菌落形成结果包括：菌落颜色的蓝色与白色的差异、菌落有无的差异、菌落多少的差异。

本发明优选的一技术方案中，待测核酸酶的靶序列选自：血管紧张素原(AGT)基因，优选具有如SeqIDNo.4或5所示的核苷酸序列。

在活细胞内核酸酶对核酸靶序列剪切后，主要发生两种方式的修复：非同源末端连接和同源修复。在原核细胞中，非同源末端连接很少发生或完全不发生；而同源修复则因序列不同导致不同的效率。

为了标准化和高效化大肠杆菌体内的基因同源重组，我们构建和比较了多种含有双重复片段的载体在核酸酶活性检测中的应用价值。三种载体均能具有检测基因工程酶活性的能力，而其中以含有人类HBV病毒重复片段和含有噬菌体LoxP重复片段的载体效率较高。

当这种双重复片段载体与蓝白斑筛选相结合时，待测靶序列和重复片段均位于alpha-多肽基因编码序列之内，并且使编码框架发生移码效果，这样的载体自身转化得到的大肠杆菌表现为白色。同时，载体构建时设计了重复片段之间发生重组反应后使基因阅读框架回复。这样，当共转化时基因工程酶使靶序列发生剪切后，可形成蓝色的菌落斑。蓝色菌落斑的形成，表明核酸酶的剪切已经发生。蓝色菌落斑的多少，与核酸酶的剪切活力的大小相关。