[发明专利]一种电化学生物传感器的制备方法及检测DNA甲基转移酶活性的方法

权利要求书

1.一种电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

（1）制备二茂铁-抗甲基化抗体；

（2）制备发夹DNA1和发夹DNA2缓冲溶液；

（3）将发夹DNA1甲基化；

（4）制备发夹DNA2修饰的金电极；

（5）构建得到电化学生物传感器：将甲基化的发夹DNA1滴加到发夹DNA2修饰的金电极上，室温下培养后得到修饰的金电极，将步骤（1）得到的二茂铁-抗甲基化抗体标记物滴加到修饰的金电极表面，室温下培养，清洗，得到电化学生物传感器，实现亚甲蓝和二茂铁信号的转换；

步骤（2）中发夹DNA1序列为: 5′-CCGGGTAGAGCTCCCTTCAATCCAACATGATA CCCGG-3′；发夹DNA2序列为: 5’-SH-CCGGGTATCATGTTGGATTGAAGGGAGCTC TACCCGG-MB-3’。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）包括以下步骤：将碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入含有二羧基二茂铁的PBS缓冲溶液中，反应物在室温下震荡1~2小时，将得到的产物重新分散在含有抗5-甲基胞嘧啶抗体的PBS缓冲溶液中，室温下震荡反应，再在4℃下保存过夜，从而得到二茂铁-抗甲基化抗体。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中将发夹DNA1加入到含有S-腺苷基甲硫氨酸和M.SssI 甲基转移酶存储溶液 ，在37℃下反应2小时，清洗，发夹DNA1实现甲基化。

4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）包括以下步骤：将发夹DNA2缓冲溶液滴加到干净的金电极表面，在黑暗环境下室温反应，超纯水清洗后，再将发夹DNA2修饰的金电极保存在含有6-巯基乙醇的Tris-HCl缓冲溶液中，以封闭剩余的空穴；得到发夹DNA2修饰的金电极。

5.一种检测DNA甲基转移酶活性的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

a、制备二茂铁-抗甲基化抗体；

b、制备发夹DNA1和发夹DNA2缓冲溶液；

c、将发夹DNA1甲基化；

d、制备发夹DNA2修饰的金电极；

e、将甲基化的发夹DNA1滴加到发夹DNA2修饰的金电极上，室温下培养后得到修饰的金电极，将得到的二茂铁-抗甲基化抗体标记物滴加到修饰的金电极表面，室温下培养，清洗，构建电化学生物传感器，将二茂铁与亚甲蓝的电信号比例构建与DNA转甲基酶浓度的线性关系，实现对DNA甲基化行为的检测检测DNA甲基转移酶活性；

所述发夹DNA1序列为: 5′-CCGGGTAGAGCTCCCTTCAATCCAACATGATA CCCGG-3′；发夹DNA2序列为: 5’-SH-CCGGGTATCATGTTGGATTGAAGGGAGCTC TACCCGG-MB-3’。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤c具体为：将发夹DNA1加入到含有S-腺苷基甲硫氨酸和不同浓度的M.SssI 甲基转移酶存储溶液 ，在37°C下反应2小时，清洗，发夹DNA1实现甲基化。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤e具体为：将5μL步骤c制备的甲基化的发夹DNA1滴加到步骤d制备的发夹DNA2修饰的金电极上，发夹DNA1和发夹DNA2实现碱基互补配对，室温下培养2小时后，得到修饰的金电极，将5μL步骤a得到的二茂铁-抗甲基化抗体标记物滴加到修饰的金电极表面室温下培养1h，标记物可以识别并连接到甲基化位点上，再用0.1M PBS缓冲溶液清洗电极，得到电化学生物传感器，实现亚甲蓝和二茂铁信号的转换，将二茂铁与亚甲蓝的电信号比例构建与DNA转甲基酶浓度的线性关系，实现对DNA甲基化行为的检测。