[发明专利]一种电化学生物传感器的制备方法及检测DNA甲基转移酶活性的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种电化学生物传感器的制备方法及检测DNA甲基转移酶活性的方法，可以实现对DNA甲基转移酶活性的灵敏检测。

背景技术

肿瘤表观遗传学是一门新兴的学科,主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质修饰、基因组印记和非编码RNA调控等几个方面。其中,DNA甲基化与肿瘤的关系是研究的热点。近年来，诸多研究表明DNA甲基化在基因表达调控、发育调节、基因组印迹等方面发挥重要作用，与某些肿瘤和遗传病的发生密切相关。随着胚胎学和肿瘤学基础研究的迅速发展，DNA甲基化受到越来越多的关注。

对于DNA甲基化的研究，目前有很多方法，大致可以分为两类：一类是从DNA甲基转移酶的角度，另一类是从DNA甲基化水平的角度进行研究；后者又分为总体DNA甲基化水平和特异基因序列DNA甲基化水平的检测。

已有研究表明，胚胎发育过程中的DNA甲基化模式的改变是个体发生的关键，其与印迹的清除和重建、x染色体的失活、种系分化等等都有密切关系。经过近半个世纪的研究，DNA甲基化水平的变化目前已是人类癌症的一种典型改变，并伴随着恶性肿瘤细胞的产生、发展而变化。

因此，快速有效的检测DNA甲基化水平的变化对肿瘤的诊断、发生、发展都至关重要。目前检测DNA甲基化的方法费力，费时，灵敏度低和不够精确。因此，探讨甲基化形成与改变的可能机制，建立准 确性好，灵敏度高，操作简单的DNA甲基化检测方法意义重大。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种电化学生物传感器的制备方法及检测DNA甲基转移酶活性的方法，利用DNA序列之间碱基的互补配对作用，甲基化后的发夹DNA1与电极上的发夹DNA2形成双链，发夹DNA2上修饰的亚甲蓝分子远离电极表面，加入二茂铁-抗甲基化抗体后修饰到发夹DNA1上的甲基化位点，从而构建了一个信号转换的电化学生物传感器，通过甲基化前后检测到的信号转换检测DNA甲基转移酶活性，实现了对DNA甲基转移酶的灵敏性、特异性、稳定性的检测。

本发明提供的一种电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备二茂铁-抗甲基化抗体；

(2)制备发夹DNA1和发夹DNA2缓冲溶液；

(3)将发夹DNA1甲基化；

(4)制备发夹DNA2修饰的金电极；

(5)构建得到电化学生物传感器。

步骤(1)包括以下步骤：将碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入含有二羧基二茂铁的PBS缓冲溶液中，反应物在室温下震荡1～2小时，将得到的产物重新分散在含有抗5-甲基胞嘧啶抗体的PBS缓冲溶液中，室温下震荡反应，再在4℃下保存过夜，从而得到二茂铁-抗甲基化抗体。

进一步的，步骤(1)具体为：将0.03834g 20mM的碳二亚胺和0.03702g 32mM的N-羟基琥珀酰亚胺加入含有2mM二羧基二茂铁的 10mL 0.1M的PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中，,在室温下震荡1～2小时，活化二羧基二茂铁的羧基之后，将2mL得到的产物重新分散在含有10μL 10mg/mL抗5-甲基胞嘧啶抗体的4mL PBS缓冲溶液中，将此溶液在室温下震荡2小时，之后，再在4℃下保存过夜，从而得到二茂铁-抗甲基化抗体。

步骤(2)包括以下步骤：将购买的分别为2.5OD的发夹DNA1、发夹DNA2序列分别溶解在Tris-HCl缓冲溶液中，分别得到发夹DNA1缓冲溶液和发夹DNA2缓冲溶液，在4℃下保存备用；

进一步的，步骤(2)中发夹DNA1序列为:

5′-CCGGGTAGAGCTCCCTTCAATCCAACATGATA CCCGG-3′；发夹DNA2序列为:5’-SH-CCGGGTATCATGTTGGATTGAAGGGAGCTC TACCCGG-MB-3’。

进一步的，步骤(2)具体为：将购买的分别为2.5OD的发夹DNA1、发夹DNA2序列分别溶解在0.1M pH＝7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，分别得到浓度为100μM的发夹DNA1缓冲溶液和浓度为100μM发夹DNA2缓冲溶液，在4℃下保存备用；

步骤(3)为：将发夹DNA1加入到含有S-腺苷基甲硫氨酸和M.SssI甲基转移酶存储溶液，在37℃下反应2小时，清洗，发夹DNA1实现甲基化；