[发明专利]一种尖吻蝮蛇凝血酶及其制备方法

说明书

本发明公开了一种高活性尖吻蝮凝血酶的制备方法。该方法将蛇毒粗品经超滤膜超滤后通过阴离子柱层析，以磷酸缓冲液洗脱后，再通过分子筛凝胶柱除热源与脱盐，最终得到高活性、高纯度的凝血酶。本发明方法与现有技术相比具有以下优点：该方法适合大规模生产、操作简单、效率高；制备的尖吻蝮属凝血酶产品产率高达8％，纯度高达99％以上，比活力不低于180U/mg。

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种尖吻蝮蛇凝血酶的制备方法。

背景技术

蛇毒是毒蛇毒腺分泌的一种成分复杂的液体，含有多种蛋白质、多肽、酶类和其它小分子物质，具有广泛的生物活性，目前研究人员已从蝰科洞蝮蛇属蝮蛇(Bothropsatrox)、长白山白眉蝮蛇等蛇毒中发现多种类凝血酶。

尖吻蝮蛇(Agkistrodonacutus)，蝰科尖吻蝮属，广泛分布于中国华南地区。尖吻蝮蛇凝血酶(HaemocoagulaseAcutus，简写为Halase)是从尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化的一种类凝血酶。它通过水解纤维蛋白的Aα链，使纤维蛋白原降解为纤维蛋白单体。专利CN1218747公开了尖吻蝮蛇凝血酶Halase用作治疗出血性疾病药物的用途，药理和毒理研究表明其具有较强的止血作用和极低的毒性。

专利CN100523185公开了一种尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的制备方法，通过透析、两步DEAE-SepharoseFF层析梯度洗脱和SephadexG25层析分离得到蛇毒类凝血酶，其纯度为95％。

专利CN101812436公开了一种单肽链的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶及其制备方法,得率为0.028％。其工艺包含三次DEAE-SepharoseFF层析，其中前两次使用酸性的低浓度NaCl-PBS溶液进行梯度洗脱，第三次层析使用碱性的低浓度NaCl-PBS溶液进行梯度洗脱。

专利CN101560510公开了一种尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶，通过在两次DEAE-SepharoseFF中使用碱性NaCl-PBS溶液进行梯度洗脱，再采用透析或Sephadex-G25脱盐制备得纯度不低于95％的产品，得率为0.7％-0.8％。

专利CN102757948公开了一种低流速下通过两次Sephadex-G75层析和一次DEAE-SepharoseFF层析制备出纯度为97.5％的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的方法。

专利CN103160485公开了一种尖吻蝮蛇凝血酶-C，通过硫酸铵分级沉淀、两次DEAE-SepharoseFF层析，最后以透析或Sephadex-G25脱盐得到比活力不低于40U/mg、纯度不低于95％的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶。

现有的从尖吻蝮蛇蛇毒中提取纯化尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的方法大多涉及长时间的透析且需多次换液，另外阴离子交换层析步骤往往要求线性洗脱或多步洗脱，存在方法复杂、效率不高等问题。

因此，有必要寻找一种简单高效、可应用于大规模生产的分离纯化工艺，制备出高活性的尖吻蝮蛇凝血酶。

发明内容

本发明目的在于提供一种尖吻蝮蛇凝血酶及其制备方法。该方法适合大规模生产、操作简单、效率高；制备的尖吻蝮蛇凝血酶产品产率高，纯度高达99％以上，比活力不低于180U/mg。

本发明提供的技术方法通过以下步骤实现：

(1)粗品澄清：以0.01M磷酸盐缓冲液溶液(pH值为6.2～6.9)溶解尖吻蝮蛇蛇毒粗品制成蛇毒溶液，蛇毒溶液经孔径0.45μm的微滤膜过滤，收集滤液；

(2)超滤除杂：将步骤(1)所得滤液经孔径10NMWC超滤膜过滤，收集滤液；