[发明专利]一种含有肽键的His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联泛素化蛋白及其提取方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种含有肽键的His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联泛素化蛋白及其提 取方法，属于肿瘤疫苗技术领域。

背景技术

肿瘤严重威胁人类的健康。治愈性切除手术或化疗、放疗是目前肿瘤病人首选的治 疗方法。临床资料显示，大部分肿瘤病人对化疗、放疗等治疗不敏感，因此，肿瘤的临 床治疗迫切需要新的方法和手段。肿瘤生物治疗作为一种新的肿瘤治疗策略，具有特异 性强、毒副作用小等优点，越来越受到人们重视。其中，以树突状细胞(DC)为载体的肿 瘤疫苗目前已成为肿瘤生物治疗的研究热点。

在肿瘤发生发展过程中，肿瘤抗原不能有效呈递给T细胞是导致免疫逃逸的重要原因。 同时在荷瘤机体中，由于存在抗原递呈细胞的功能低下甚至缺陷，特别是DC在数量和功能 的改变，可造成肿瘤细胞逃避机体的免疫监视，导致肿瘤的形成和发展。目前，基于DC的 肿瘤疫苗被认为是最有效的肿瘤疫苗之一，已开展大量基础研究和临床试验。DC疫苗功能 的实现主要取决于两部分因素，一是DC的有效抗原提呈作用；二是负载有效的抗原，抗原 信息得以充分表达。然而，研究试验中存在许多问题有待解决，包括DC来源、制备过程、 DC的抗原负载、用量、使用频度、免疫途径和次数，以及如何更好的募集肿瘤抗原等成为 目前关注的热点。

pAPC(professionalantigenpressingcell,专职抗原提成细胞)交叉递呈的抗原多肽 是诱导特异性效应细胞的物质基础、而肿瘤细胞直接递呈的抗原多肽是效应细胞有效识 别并杀伤肿瘤细胞的靶点。一方面，肿瘤细胞直接递呈的抗原多肽主要来源于肿瘤细胞 的短寿蛋白(平均半衰期约为10分钟)；另一方面，pAPC交叉递呈的抗原多肽主要来源 于肿瘤细胞的长寿蛋白(经自噬途径降解)，两者间可能存在着不对称现象，因此，解决 上述的不对称性是肿瘤免疫需要解决的课题。如何充分利用肿瘤细胞产生的全部抗原信 息，诱导能更有效识别肿瘤细胞的特异性效应细胞是目前以“长寿蛋白”为基础的肿瘤疫苗所 面临的难题。

目前认为抗原供者细胞主要有两条蛋白降解途径：泛素-蛋白酶体途径和细胞自噬 途径。其中，泛素-蛋白酶体途径主要由蛋白酶体降解处理泛素化短寿蛋白，短寿蛋白 主要包括一些错误编码、错误翻译等产生的核糖体废产品，半衰期仅为10分钟。近年 来发现，肿瘤细胞MHCI(majorhistocompatibilitycomplexI,主要组织相容性复合体I) 类分子直接递呈的抗原肽有80％以上来源于短寿蛋白。泛素分子作为胞内信号分子能以 一种极其严密的方式标记蛋白分子。泛素分子与靶蛋白或者另一个泛素分子偶联的过程 是由一系列分子调控完成的，这些分子有泛素活化酶(E1)，泛素交联酶(E2)和泛素连接 酶(E3)；最终使泛素分子偶联到多肽链Lys残基的ε-氨基或者末端氨基酸的最末端基团， 随后，另一个泛素分子会通过与前一个泛素分子的Lys48连接而形成泛素链。这种连接 类型的泛素链在很大程度上是作为蛋白酶体识别的标志。被泛素化的底物进入蛋白酶体 后很快就被蛋白酶体所降解。

前期我们通过将一个人工构建的泛素化蛋白结合蛋白(His-Vx3-eGFP)的基因序列 导入大肠杆菌(DH5α)并诱导其表达，采用镍离子层析的方法以得到泛素化蛋白并且 具有显著的抗肿瘤效果。

目前，现有技术中虽然已经有泛素化蛋白的研究，但是，仍存在以下问题需要解决， 如募集泛素化蛋白的方法复杂难以大批量生产；所得的泛素化蛋白稳定性差不利于保 存；将其作为肿瘤疫苗时需要添加纳米铝佐剂。

发明内容

发明目的：为了解决上述技术问题，本发明公开了一种His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝 共价偶联泛素化蛋白及其提取方法。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明提供了一种含有肽键的His-Vx3-eGFP 蛋白-纳米铝共价偶联泛素化蛋白，所述泛素化蛋白是由His-Vx3-eGFP蛋白和经过修饰 后的纳米铝，通过肽键形成偶联物，然后偶联物再与经过处理后的肿瘤细胞裂解液孵育， 即得所述泛素化蛋白。

本发明还公开了所述含有肽键的His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联泛素化蛋白的 提取方法，包括以下步骤：

(1)利用对羟基苯甲酸，对纳米铝颗粒进行修饰；