[发明专利]一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒，包括酶标板、样品稀释液、辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体、阳性对照、阴性对照、显色液A、显色液B、终止液、洗涤液；其特征在于：

所述的酶标板是以GPYTGPLERQKPLKC作为合成肽的序列与载体蛋白OVA进行偶联的多肽作为包被抗原，以0.1mol/LpH9.6的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液；

所述的样品稀释液：含0.5％M/VBSA的PBS缓冲溶液；

所述的辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，以合成肽作为免疫原制备的单克隆抗体；

所述的阳性对照血清为合成肽抗原免疫的兔高免血清；

所述的阴性对照为未感染口蹄病毒的健康猪牛羊血清；

所述的显色液A为含有50mg/mL的过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲溶液；

所述的显色液B为含有0.2mg/mLTMB，pH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液；

所述的终止液为含0.25％体积比氢氟酸溶液；

所述的洗涤液为含有0.05％V/VTween-20的PBS缓冲液。

2.权利要求1所述的一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒，其特征在于：所述的单克隆抗体细胞株命名为杂交瘤细胞株4G6，CCTCCNO：C201639。

3.权利要求1或2所述的一种抗口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的单克隆抗体的制备方法，其步骤是：

A、饲养细胞的制备：

在融合前一天，取一只正常雌性BALB/c鼠，75％V/V酒精消毒5min，甩干后移入超净工作台内，固定于经紫外消毒的泡沫板上，用灭菌眼科剪、弯头镊子剪开皮肤，用10mL一次性注射器吸满含20％V/V胎牛血清的HAT选择培养液注入小鼠腹腔，再用注射器抽出腹腔内的培养液，注入灭菌平皿中，加上述培养液调整细胞密度至10⁶个/mL，用多道移液器分别接种至4块96孔细胞培养板，每孔100uL，置37℃，5％CO₂培养箱中培养；

B、制备免疫脾细胞：

取浓度的3B-KLH抗原与等体积佐剂充分混匀，免疫5周龄的BALB/c小鼠，注射剂量为60～100微克，每间隔两周皮下免疫一次、连续免疫三次后，融合前3天腹腔加强免疫，第一次免疫时使用弗式完全佐剂，第二、三次使用弗式不完全佐剂，将脾脏移入另一盛有10mL基础培养液的平皿中，用针头在顶端穿孔，用一次性无菌注射器吸取5mL基础培养液，从脾脏一端注入，使液体从脾脏另一端针孔流出，将脾细胞悬液转至10mL无菌离心管中，1000rpm离心10min，细胞沉淀用基础培养基离心洗涤一次，然后将细胞重悬，计数后备用；

C、制备骨髓瘤细胞：

在融合前两周将在液氮中冻存的SP2/0骨髓瘤细胞取出复苏，用加有8-氮鸟嘌呤的1640完全培养基选择培养三代，用1640完全培养基进行扩大培养，1000rpm离心10min，弃去培养液，用基础培养液洗2次后将细胞重悬，记数后备用；

D、细胞融合：

先将免疫脾细胞1000r/min离心5min去掉上清，于37℃放置备用，将1×10⁷个SP2/0与10⁸个免疫脾细胞于50mL离心管中混匀，离心10min，倒空上清，用灭菌的滤纸吸干管壁，将装有细胞混合物的离心管放于37℃水浴中，在1min内滴入预温至37℃的50％PEG0.8mL，边加边用吸管尖搅拌，然后加入37℃预温的基础液10mL，第一分钟逐滴滴入1mL，第二分钟加1mL，第3-4分钟加3mL，第5分钟加其余的5mL，并不断地搅拌，最后加入30mL1640液，800r/min离心5min，去上清于37℃放置5min，用HAT培养基悬浮，同时也用HAT培养基悬浮饲养脾细胞与融合后的细胞混合，一次融合接种4块96孔板，于37℃5％CO₂培养箱中培养，进行抗体检测；

E、阳性细胞的筛选和克隆：

在包被有口蹄疫非结构蛋白3B-OVA合成肽抗原的包被板中加入96孔细胞培养板上的细胞上清，于37℃温育1h，洗涤3次，加入1:5000稀释的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反应30min，洗涤3次，加入显色液显色，终止反应之后，用酶标仪测每孔的读值；

F、阻断单抗的筛选鉴定：

在包被有口蹄疫非结构蛋白3B-OVA合成肽抗原的包被板中加入口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体阴、阳性血清，37℃温育1h，洗涤3次后加入初步筛选阳性孔细胞的上清，37℃温育1h，洗涤3次后加入稀释好的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反应30min，洗涤3次，加入显色液显色，终止反应之后，用酶标仪测每孔的读值，选取具有阻断效果的单抗。

4.权利要求1所述的一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒的检测方法，其步骤是：

1)将待检血清按1:2比例稀释于血清稀释板中，吸取稀释好的样品液加入包被好抗原的酶标板中，每孔加入100μL，37℃反应1h；

2)次日，用洗涤液洗板5次，最后一次拍干；

3)加入100μL酶标抗体，37℃作用1h；

4)取出酶标板，甩掉孔中溶液，用洗涤液洗板5次，最后一次拍干；

5)加入显色液A50μL、显色液B50μL，混匀后室温避光显色10min，每孔加入终止液50μL，15min内用酶标仪测定每孔的OD_630nm读值；

6)阻断率计算：阻断率＝1-S/N；

7)试验成立条件：阴性对照OD_630nm大于0.500，阳性对照的阻断率大于60％；8)判定标准：猪、牛、羊血清阻断率大于等于0.4判为非结构蛋白3ABC抗体阳性，血清阻断率小于0.4判为非结构蛋白3ABC抗体阴性。