[发明专利]一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗 体的阻断ELISA试剂盒，同时还涉及一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻 断ELISA试剂盒的检测方法。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-mouthdisease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth diseasevirus,FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性的 传染病，感染后发病率100％。临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水 疱性疹。该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大政 治、经济损失。鉴于此，世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类传染病之首。目前， 有三分之二的OIE成员国流行FMD，时刻威胁着无FMD国家和地区的家畜安全 和畜产品贸易。

区分FMD野毒感染动物和疫苗免疫动物能准确反映一个地区的FMD感染状 态，也是OIE判断一个国家或者地区有无FMD的依据。目前畜牧业生产中使用 的口蹄疫疫苗主要是灭活疫苗，疫苗在制备过程中，病毒经过灭活，纯化和乳化 等过程，非结构蛋白受到严重破坏，疫苗中几乎不存在非结构蛋白，因此，免疫 动物体内无非结构蛋白抗体。感染口蹄疫野毒的动物，病毒经过生物合成和组装 过程中产生非结构蛋白，因此野毒感染动物体内存在非结构蛋白抗体。所以，检 测非结构蛋白抗体可以区分免疫动物和感染动物。经过各国学者多年的研究，已 证明检测非结构蛋白3ABC是确定动物是否感染口蹄疫的最佳方法。

在口蹄疫抗体的诊断过程中，ELISA与其他免疫学检测技术相比具有灵敏、 特异、快速且易于实现自动化操作等优点，检测抗体的ELISA方法一般分为间接 ELISA和阻断ELISA或者竞争ELISA，间接ELISA方法容易出现非特异性反应，而 阻断ELISA或者竞争ELISA采用了单克隆抗体和阻断技术，方法更为敏感和特异； 本专利所采用的方法即为阻断ELISA方法，使试剂盒具有很好的敏感性和特异性。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断 ELISA试剂盒，该试剂盒的优点在于使用了合成肽为包被抗原和辣根过氧化物酶 标记的单克隆抗体，减少了非特异性反应，提高了检测的灵敏性和特异性。

本发明的另一个目的是在于提供了一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的 阻断ELISA试剂盒的检测方法，该方法敏感性强、特异性好与其荷兰Ceditest试 剂盒的总符合率为91.06％，有着很好的应用前景。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒，包括酶标板、 样品稀释液、辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体、阳性对照、阴性对照、显色液 A、显色液B、终止液、洗涤液。

所述的酶标板是以GPYTGPLERQKPLKC作为合成肽的序列与载体蛋白OVA进 行偶联的多肽作为包被抗原，以0.1mol/LpH9.6的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液；

所述的样品稀释液：含0.5％(M/V)BSA的PBS缓冲溶液；

所述的辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，以合成肽作为免疫原制备的单 克隆抗体；

所述的阳性对照血清为合成肽抗原免疫的兔高免血清；

所述的阴性对照为未感染口蹄病毒的健康猪牛羊血清；

所述的显色液A为含有50mg/mL的过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲溶液；

所述的显色液B为含有0.2mg/mLTMB，pH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液；

所述的终止液为含0.25％体积比氢氟酸溶液；

所述的洗涤液为含有0.05％(V/V)Tween-20的PBS缓冲液；

所述的单克隆抗体，其制备过程是采用杂交瘤细胞技术，以 GPYTGPLERQKPLKC作为合成肽序列与载体蛋白KLH进行偶联，偶联后的合成肽 作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，通 过HAT培养基筛选，经过阻断ELISA筛选出来的阳性单克隆抗体，命名为杂交瘤 细胞株4G6，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCCNO： C201639。

一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒的检测方法，其步 骤是：