[发明专利]一种提高丝状真菌木质纤维素酶系表达及生物基化学品生产的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，一种提高真菌降解木质纤维素或是生产纤维素酶、半纤维素酶；提高微生物糖的转运吸收及其在生物基化学品发酵生产中的应用，涉及2个糖转运蛋白基因NCU10021（HGT-1）或其同源基因和NCU04963（HGT-2）或其同源基因。

背景技术

植物纤维素是自然界中存在最广泛、含量最丰富的碳水化合物。随着地球传统能源的快速消耗、环境污染和能源危机的日益加剧，纤维素作为潜力巨大、环境友好的可再生能源成为研究的重点。作为地球上含量最丰富的可再生资源，纤维素的利用效率却远远低于社会发展的要求，若能将其高效地转化为可利用的能源、食料和化学原料等，势必将会对人类社会的可持续发展起到关键作用。要利用这些储量巨大的生物质资源，需要糖化和发酵两个基本步骤。其中，如何将生物质高效地水解为单体化合物（葡萄糖、木糖等）已成为其利用过程中的一个迫切需要解决的问题。

自然界有一大类真菌能够自由生长在枯萎或腐烂的植物上，它们是生态圈的分解者。这类真菌大多属于腐生型的丝状真菌。丝状真菌粗糙脉孢菌很早就被发现具有降解利用纤维素的能力，是典型的纤维素降解真菌。在提高生物质降解效率的研究中，传统诱变技术已经取得了重大进步，提升空间有限。因此，本领域迫切需要开发能够提高纤维素酶生产从而提供菌株对纤维素利用的技术和方法。丝状真菌分泌的一系列木质纤维素酶，能将高聚化的纤维素和半纤维素降解为可溶解、可利用的简单糖类，如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖，以及各种寡糖，包括纤维寡糖（二糖、三糖等等）和木寡糖。细胞欲利用这些简单的糖类，首先需要将这些膜不透过性营养分子转运进胞内。因此，糖的转运成为了解析纤维素降解利用的第一步，也是关键步骤之一

丝状真菌糖转运蛋白多属于膜蛋白家族MFS（major facilitator superfamily）。依据转运的机制，MFS又分为简单转运蛋白（uniporter），又称协助扩散蛋白（facilitated diffusion protein），同向转运蛋白（symporter）以及反向转运蛋白（antiporter）。Uniporter，依靠底物浓度梯度驱动转运，转运蛋白主要起着协助运输的作用。Symporter，向同一个方向同时转运两种及以上的底物，并以其中一种底物的电化学梯度作为推动力，常见的有sugar/H+，glucose/Na+，phosphate/H+，nucleoside/H+以及nitrate/H+等等。Antiporter，向反方向协同转运两种及以上的底物，驱动力来源和symporter一样，这一类里很多都是drag/H+反向转运蛋白。真菌中的糖转运蛋白主要是uniporter和symporter/H+类型。由于自然界中脉孢霉能生长在各种干枯的木质纤维上，可以预见其糖转运蛋白家族具有很高的功能多样性。同时，在长期的进化适应过程中，细胞面对不同的生长环境，如酸性-碱性，碳充足-碳匮乏，会有很好的策略来协同这些转运蛋白之间的转运工作，以使得其能高效地吸收外界的营养。通过研究和改造糖转运蛋白，提高糖的转运吸收，对改造工程菌（包括酵母，曲霉，木霉）以充分利用培养基中的残糖发酵，提高糖的转化利用率具有重要意义。

木质纤维素的主要成分是纤维素和半纤维素，其水解产物主要包括葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖等。实现糖的共利用和高效利用一直是研究热点。然而，对多数微生物来说，葡萄糖的存在会限制其他糖的利用，称之为碳代谢物抑制（carbon catabolite repression, CCR）。CCR可以增加微生物对环境的适应和竞争力，所以对微生物自身来说CCR是有利的，而对工业应用来说，则是不利的，优先利用碳源会抑制其他碳源代谢过程所需酶基因的表达，如葡萄糖抑制纤维素酶的表达分泌，从而导致微生物不能利用纤维素。解除CCR的抑制作用，可以实现糖的共利用，快利用，从而提升工业菌株的生产能力。葡萄糖阻遏效应是一个复杂的过程，葡萄糖转运蛋白是其中重要的参与基因，通过研究调控葡萄糖转运蛋白，可以调控葡萄糖转运和下游阻遏效应，进而促进木糖等其他糖的利用，对实现生物质各类糖的共利用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高木质纤维素降解及纤维素酶、半纤维素酶表达的方法及其在糖利用中的应用。

本发明提供了一种提高丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达、和/或提高丝状真菌的纤维素降解活性的方法，包括步骤：

抑制丝状真菌两个保守的葡萄糖转运蛋白基因的表达和/或活性，从而提高丝状真菌纤维素和/或半纤维酶的表达、和/或提高丝状真菌的纤维素降解活性。