[发明专利]一种生物识别分子固定到生物芯片的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物芯片修饰领域，具体涉及一种生物识别分子固定到生物芯片的方法。

背景技术

将生物识别分子高效固定到生物芯片上是发展高灵敏度、高特异性生物分析技术的关键之所在。近年来，基于生物芯片、生物传感器等的生物分析技术由于具有灵敏度高、特异性强、检测通量大等特点，在药物开发、环境监测、食品检测、医疗诊断等领域得到了广泛的应用。绝大多数生物分析技术至关重要的一步就是要把特定的生物识别分子(如DNA、抗体或抗原、核酸适体、分子印迹分子等)固定到生物芯片上，以制备可以特异性识别待测目标物的敏感膜。将生物识别分子固定到生物芯片上的方法包括物理吸附法、包埋法、共价键法等。物理吸附法是将DNA、抗体/抗原等生物识别分子固定到生物芯片上最简单的方法，缺点是固定的生物识别分子量少且易脱落以及生物识别分子不定向吸附导致活性损失等。包埋法是利用高分子有机聚合物将生物识别分子包埋，并固定到生物芯片的方法，该方法的缺点是非常明显的，即高分子有机聚合物可阻碍生物分子的亲和作用，同时非特异性吸附量大，因此在生物芯片的制备过程中应用得较少。共价键法是利用化学键合的方式将抗体/抗原、DNA、分子印迹分子、核酸适体等生物识别分子固定到生物芯片上，其特点是结合牢固、生物芯片可重复使用，但是生物识别分子活性会因化学键合而降低，同时生物识别分子不定向固定到生物芯片可使得其活性损失，从而降低生物分析技术性能。因此，如何获得生物识别分子活性高、均匀性与一致性好、载量大、非特异性吸附弱、可重复利用的生物芯片一直是现代生物分析技术的难点和热点。

发明内容

鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种生物识别分子固定到生物芯片的方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种生物识别分子固定到生物芯片的方法，包括以下步骤：

1)生物芯片的清洗：将生物芯片浸渍于羟基化试剂中，得到清洁的表面羟基化的生物芯片，之后进行干燥；

2)生物芯片的硅烷化：将步骤1)干燥后的羟基化的生物芯片浸渍于带有琥珀酸酐基团的硅烷化试剂中，进行硅烷化反应，得到硅烷化的生物芯片；

3)将步骤2)得到的硅烷化的的生物芯片冲洗干净后置于水中，进行羧基化反应，得到羧基化的生物芯片；

4)将步骤3)得到的羧基化生物芯片放入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中，进行活化羧基反应；

5)将步骤4)得到的活化羧基反应后的生物芯片放入生物识别分子的溶液中，进行缩合反应，得到表面固定有生物识别分子的生物芯片；所述生物识别分子具有氨基。

本发明的有益效果是：

步骤1)中利用利用羟基化试剂将生物芯片羟基化；步骤2)中，将羟基化的生物芯片浸渍于带琥珀酸酐基团硅烷化试剂中进行反应；步骤3)中，硅烷化试剂的琥珀酸酐基团水解生成羧基基团；步骤4)中，利用NHS和EDC，活化羧基，有利于与生物识别分子的连接；步骤5)中，生物识别分子的氨基和活化后的羧基进行缩合反应生成酰胺键，实现了生物识别分子直接固定到生物芯片表面，本发明方法修饰的生物芯片由于生物识别分子能定向排列，形成分布均匀、载量大、活性高的单分子结构，且结构致密。

本发明采用带琥珀酸酐基团的硅烷化试剂，能够方便、简单连接带氨基的生物识别分子，使生物识别分子能定向排列，形成均匀、致密的单分子结构，提高生物识别分子的识别效率，同时避免了非特异性吸附，从而有效提高生物芯片的检测效果。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，步骤1)中，所述羟基化试剂为浓硫酸和双氧水按体积比2：1 至3：1混合后得到的混合物；所述浸渍的温度为15-35℃，时间为 25-60min。

采用上述进一步方案的有益效果是：采用上述比例有利于生物芯片羟基化，如果浓度过高或过低，导致生物芯片的羟基含量低；如果温度过低、时间较短将导致生物芯片羟基化不完全，如果如果温度过高、时间较长将导致破坏芯片表面结构。

进一步，步骤2)中，所述硅烷化试剂为二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基] 呋喃-2,5-二酮(简写为TEPSA)的无水丙酮溶液，该溶液中，二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2,5-二酮的体积分数为2％-10％。