[发明专利]一种用于微拟球藻基因沉默的RNAi载体及其应用

说明书

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及公开一种用于微拟球藻基因沉默的RNAi载体及其应用。载体以硅藻用RNAi表达载体作为骨架，微拟球藻内源基因微管蛋白(tubulin)启动子、抗性选择标记基因和靶基因。所述的用于微拟球藻基因沉默的RNAi载体在基因转化中的应用。本发明为微拟球藻基因功能研究提供了一种新的模型和可行性方法。

技术领域

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及公开一种用于微拟球藻基因沉默的RNAi载体及其应用。

背景技术

微藻是一个具有高度多样性的生物群体，广泛分布于海洋、胡泊、陆地等各种栖息环境，也是地球上最古老的生命类群之一。它们不仅在生态系统中扮演着重要角色，而且在进化关系上也跨越原核和真核生物两界。因此，它们拥有相对独特的进化地位，微藻进化研究一直是科学研究的热点问题。由于微藻进化历史和栖息环境的多样性和复杂性，不同的藻类在代谢途径、细胞发育调控以及生活史等发面都有差异及其独特性，而我们对其认识是非常有限的。另外，随着全球化石能源日益短缺，以及现代工农业的发展带来的全球气候变暖等问题，发展清洁、可再生型新能源已成为必然趋势，微藻生物能源就是其中被寄予厚望的救世主，同时微藻也能够用于生产多种高附加值化学品(如多糖、多不饱和脂肪酸和虾青素)，广泛用于食品、保健品和化妆品等方面工业应用。微藻生物学功能的研究将有助于我们理解微藻遗传资源和加以利用，这些都迫切需要人类去认识微藻及改造微藻。

随着高通量基因测序的发展，许多藻类的基因组已经被测序，包括莱茵衣藻、硅藻、微拟球藻、小球藻、团藻、褐藻和红藻等。尽管对其开展全基因组测序，但是它们基因绝大多数(占30％以上)都是未知功能的，对于代谢过程的理解仍然是一个“黑箱”。这就需要我们发展遗传转化方法和基因操作工具去揭开这个“黑箱”之谜。反向遗传学工具如插入突变、靶基因的敲除只有在少数几个微藻(莱茵衣藻等)中建立。另外，据报道在微藻中建立同源重组方法是相对较困难的。因此，为实现基因的功能研究，RNAi技术是一种比较好的选择，而且通过基因组测序发现，在绝大多数微藻中都存在有RNAi元件如Dicer酶、RNA依赖的RNA聚合酶和Arogonute蛋白等。RNAi指通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA和反义RNA),从而诱导内源靶基因的mRNA降解,达到阻止基因表达的目的。RNAi发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内，并且在莱茵衣藻、三角褐指藻和杜氏盐藻中建立了RNAi反向遗传学工具用于基因功能研究。

微拟球藻是一种单细胞光合微藻，广泛分布于海洋、淡水等环境 水域。由于它的油脂含量高、较好的环境适应性及适于烟道气培养等特性，在微藻生物能源领域备受青睐。截至目前，已有多株微拟球藻的全基因组测序，基本涵盖了本属内的已知代表物种。同时，遗传转化方法也基本已经建立，反向遗传学工具如插入突变、过表达和同源重组的方法在不同种里面也有报道，唯独RNAi这一强有力的遗传工具尚未建立，而本申请专利建立的方法将填补这一空白，将与其他遗传工具形成互补，能够更好地用于微拟球藻基因功能及未来的大规模遗传筛选研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于微拟球藻基因沉默的RNAi载体及其应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种用于微拟球藻基因沉默的RNAi载体，载体以硅藻用RNAi表达载体作为骨架，微拟球藻内源基因微管蛋白(tublin)启动子为启动子、终止子、抗性选择标记基因和靶基因。

所述微拟球藻内源基因微管蛋白(tubulin)启动子为

(1)具有序列表SEQ ID No.1中的核苷酸序列；

或，(2)具有与序列表中SEQ ID No.1的DNA序列有较高的序列同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。