[发明专利]一种开发黄姑鱼SSR分子标记用于种群鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及黄姑鱼的种群分子遗传学的技术，具体是一种开发黄姑鱼SSR分子标 记用于种群鉴定方法。

背景技术

黄姑鱼(Nibeaalbiflora)属硬骨鱼纲、鲈形目、石首鱼科，黄姑鱼属，是我国重 要的海水经济鱼类，系暖温性近海中下层鱼类。我国黄、渤海、东海及南海均有分布。黄姑鱼 的人工育苗技术已经成功，并且近年来在浙江、福建的养殖规模不断扩大，成为我国沿海重 要的海水养殖经济鱼类。由于过度捕捞以及人类活动导致的海洋环境的污染破坏，导致黄 姑鱼渔业资源急剧衰退，野生资源显著下降；因此黄姑鱼种质资源及遗传多样性和遗传结 构的分析，对我国重要渔业种质资源的保护和合理开发利用具有极其重要的意义。然而，目 前关于黄姑鱼的研究主要集中于生态学与人工养殖技术方面的进展，相关的群体遗传学的 研究报道也仅限于使用形态学的特征，细胞生物学染色体核型比较，同工酶分析，线粒体 COI基因序列和AFLP片段相关的研究，尚未有基于短片段重复序列（SSR）标记的遗传结构和 群体研究。

遗传标记是指和某种性状关联和共分离的遗传物质，包括形态学标记，生物化学 标记，细胞学标记和分子标记等几种表现形式，其中的分子标记反映生物个体间或种群间 基因组中某种差异特征的DNA片段或则碱基，它直接反映基因组DNA间的差异，主要包括 RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism),RAPD(RandomAmplified PolymorphicDNA),AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism),SSR(Simple SequenceRepeat)等。但是，随着基因分型技术的发展，由于RFLP，RAPD和AFLP技术操作繁 琐和复杂，对基因组DNA要求高等缺点，这些类型的标记已用得越来越少。SSR是生物体基因 组中短片段模块（一般1到6个碱基构成）的重复造成的，主要由核心片段和二端的侧翼序列 构成。实验中可以利用SSR二端侧翼的保守性进行基因组扩增，研究个体与群体的多态性。 由于SSR具有检测方便，基因组内部分布广泛，多态性高等特点，在SSR在遗传学研究中发挥 着越来越重要的作用。目前，SSR标记已经成功并广泛的应用于重要经济物种的群体和遗传 结构研究，遗传图谱构建，重要性状QTL定位和全基因组关联分析中。

为了对黄姑鱼的群体和遗传结构进行分析，需要大量的SSR分子标记。目前，黄姑 鱼的SSR分子标记的开发主要依赖于FIASCO（fastisolationbyAFLPofsequences containingrepeat）方法。随着基因组学和转录组学的发展，科研人员可以轻易的获得真 核生物的EST和表达基因序列。这些序列为物种SSR的开发提供了宝贵的序列信息，节省了 SSR标记开发成本，提高了标记分离的效率。而且，从转录组序列中分离得到的SSR标记可能 来自于功能基因，因而这些标记可能与基因的生物学功能直接连锁，因而相应的标记的生 物学和遗传意义更大。目前，尚未有黄姑鱼基于转录组基因序列分离的SSR分子标记用于种 群鉴定的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从通过转录组序列获得潜在SSR分子标记，在基因组 DNA上进行实验验证的方法，并利用SSR标记的多态性构建快速和准确进行黄姑鱼种群鉴定 的方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种开发黄姑鱼SSR分子标记用于种群鉴定方法，包括以下步骤：

（1）通过提取不同发育阶段的混合组织样本，进行RNA建库测序，获得黄姑鱼的基因表 达序列数据；

（2）对转录组序列利用MISA软件挖掘其中的SSR标记，选择部分SSR标记针对其测翼序 列设计引物，用于后续实验验证和筛选；

（3）使用黄姑鱼鱼鳍提取基因组DNA，用每一对SSR引物对不同黄姑鱼个体的基因组 DNA模板进行PCR扩增，对扩增产物进行毛细管电泳检测，从中筛选出扩增结果有差异的 引物，用于黄姑鱼的群体的多样性研究；

（4）利用所筛选的SSR引物对所鉴定黄姑鱼的基因组DNA进行遗传参数的分析，计 算各个SSR座位上的等位基因组成，基因杂合度和多态信息含量；