[发明专利]一种猪伪狂犬病毒的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种培养方法，具体涉及一种猪伪狂犬病毒的培养方法。

背景技术

猪伪狂犬病毒属于猪疱疹病毒属，在全世界广泛分布。目前，各个研究机 构对经典毒株和临床分离的猪伪狂犬病毒进行了体外细胞感染，并已研制出相 关疫苗进入商品化销售。

国内外有多篇文献报道指出，猪伪狂犬经典株与临床分离到的猪伪狂犬病 毒可以用多种细胞进行体外感染，如VERO细胞、ST细胞等，实验室病毒培养 滴度一般在10⁷TCID₅₀，但对于疫苗生产企业来讲，病毒的滴度越高，单位时间 内生产病毒的效率就越高，生产成本也就越低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：对于疫苗生产企业而言，现有猪伪狂犬病 毒的培养方法培育得到的溶液的病毒滴度较低、生产成本较高；目的在于提供 提高猪伪狂犬病毒体外感染效率，有效提高培育后溶液病毒滴度的一种猪伪狂 犬病毒的培养方法；本发明大大提高工业化生产猪伪狂犬病毒效率，为生产企 业提高猪伪狂犬疫苗质量、降低生产成本提供方法和依据。

本发明通过下述技术方案实现：

一种猪伪狂犬病毒的培养方法，包括：

(1)配置细胞亲和剂，将细胞亲和剂的各物质溶于去离子水中并过滤；

其中，细胞亲和剂包括苹果酸、草酸、山梨酸、磷酸、磷酸氢二钠、氯化 钾和氯化钠；

(2)配置适用于猪伪狂犬病毒培育的DMEM培养液；即将DMEM溶于去 离子水中，搅拌至完全溶解，调节pH值至6.8～7.8，并用0.22um的无菌滤膜 进行除菌过滤，放4℃待用；

(3)培育单层细胞；即将胎牛血清加入DMEM培养液混合后制成溶液， 血清加入体积范围为DMEM培养液体积的1％～8％，将细胞加入到该溶液中进 行单层培养，待培养好后弃去溶液保留细胞，并用无血清液体清洗后获得单层 细胞；

(4)将单层细胞、DMEM培养液以及细胞亲和剂混合均匀，然后放置细胞 培养箱中静置1～30min；该细胞亲和剂的质量终浓度为0.01％～1％；

(5)静置完成后取出，并迅速加入猪伪狂犬病毒混合均匀，最后放置到细 胞培养箱进行培养，直至细胞病变脱落。

本发明通过优化复合酸与无机盐的组成物质的优选配合，有效改变猪伪狂 犬病毒与细胞间的微环境，增加病毒与细胞接触亲和度，从而增加病毒对细胞 的感染率，进而有效增加猪伪狂犬病毒的滴度，降低生产成本。

本发明通过优化细胞亲和剂的使用量，不仅仅能有效增加猪伪狂犬病毒的 滴度，而且还能有效减少培育时间，效果对比结果如表2所示，通过表2可知， 细胞亲和剂的使用量的优化使伪狂犬病毒的滴度增强数倍以上，且培育时间至 少要节省四分之一，效果更加显著。

优选地，所述苹果酸为1～10份，草酸为1～12份，山梨酸为1～10份， 磷酸为0.1～1份；所述磷酸氢二钠为1～16份，氯化钾为6～60份，氯化钠为 1～9份。

优选地，所述苹果酸为1～10份，草酸为1.2～12份，山梨酸为1～10份， 磷酸为0.1～1份；所述磷酸氢二钠为5～7份，氯化钾为6～10份，氯化钠为3～ 8份。

通过采用上述优选组成和配比的细胞亲和剂，并将其使用到病毒生产后， 不仅仅使病毒滴度从原先的10^7.0TCID₅₀每毫升增加至10^9.2TCID₅₀每毫升，病毒 滴度比原先提高近100倍。

而且病毒感染细胞后，通常至少需要48h以上才能达到细胞病变脱落的目 的，而加入本发明优化组分和配比的细胞亲和剂后，仅仅只需要不到36h即可 使细胞病变脱落，细胞病变速度显著加快，节省培育时间。

优选地，所述细胞包括Vero细胞、293细胞、ST细胞、BHK细胞中的一种 或多种；所述无血清液体为无菌去离子水、无菌PBS、无菌无血清DMEM培养 液；所述无血清液体的清洗次数为2～3次。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明通过优化复合酸和无机盐的组成物质，有效改变猪伪狂犬病毒与 细胞间的微环境，增加病毒与细胞接触亲和度，从而增加病毒对细胞的感染率， 进而有效增加猪伪狂犬病毒的滴度，降低生产成本；