[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于动物病毒学和分子生物学技术领域，涉及一种猪流行性腹泻病毒的多 重RT-PCR检测试剂盒，具体为针对变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株一步法三重RT-PCR的 检测方法及应用。

背景技术

猪流行性腹泻（porcineepidemicdiarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒 （porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，该病 的主要特征是急性水样腹泻、呕吐和脱水死亡；各种年龄阶段的猪只均易感，对1～2周龄哺 乳仔猪危害最为严重，发病死亡率可高达90%～100%，给养猪业造成了严重的危害和经济损 失。20世纪70年代，英国和比利时各自率先报道了该病的发生，随后该病在世界上多个主要 养猪国家相继暴发和流行，近年来亚洲一些国家如泰国、韩国、越南和中国多次报道了PED。

PEDV是套式病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒亚科 （Coronavirinae）甲型冠状病毒属（Alphacoronavirus）的成员，为有囊膜的单股正链RNA病 毒。PEDV基因组全长约28Kb，包括5’端非编码区、3’端非编码区以及至少７个开放阅读框 （ORF1a,ORF1b,ORF2~6），分别编码主要结构蛋白：纤突蛋白（S）、膜蛋白（M）、核衣壳蛋白 （N）、小包膜蛋白（E）和非结构蛋白（复制酶1a、1b、ORF3蛋白）。S蛋白为Ⅰ型跨膜蛋白，位于病 毒粒子的表面，它在诱导感染宿主中和抗体的产生、与特异性受体的结合及细胞膜融合方 面发挥着十分重要的作用。此外，冠状病毒S基因的变异可以引起病毒组织嗜性的改变和病 毒毒力的变化。ORF3基因是PEDV的一个附属基因，编码一种离子通道蛋白，可调节病毒产 量，可能病毒的毒力有关。PEDV弱毒疫苗株的ORF3基因在245-294bp存在49或51个核苷酸的 缺失，是弱毒株重要的分子标记。

2010年底开始，PED在我国大范围暴发流行，临床上主要表现为高发病率和高死亡 率的哺乳仔猪腹泻（病死率达80%～100%），造成了大量的哺乳仔猪死亡。当前，我国流行 PEDV毒株主要存在两种类型，即PEDV经典毒株和PEDV变异毒株，并且以变异毒株为优势流 行毒株。PEDV基因组中变异最大的区域位于S基因，且大多数的变异都聚集在S基因的N端。 与早期流行的经典毒株（PEDVCV777）相比，PEDV变异毒株的S基因在N端存在15个碱基的插 入和6个碱基的缺失，从而导致流行毒株Ｓ蛋白的抗原位点、糖基化位点和跨膜螺旋均有明 显变化。此外，研究显示在采集的临床样品中还存在与弱毒疫苗株高度同源的毒株。

当前我国广泛流行的PEDV以变异毒株为优势毒株、经典毒株并存为特点，再加上 弱毒株的广泛使用，使得临床上的PEDV毒株错综复杂。常规检测病毒分离、免疫组化、免疫 荧光试验及常规RT-PCR等并不能区分PEDV毒株类型；基因测序是鉴定毒株类型的有效方 式，但该方法操作复杂、消耗时间长、费用成本高。我国目前尚无鉴别诊断猪流行性腹泻病 毒变异株、经典毒株和弱毒疫苗株的多重RT-PCR方法。因此，有必要建立一种快速简便有效 的猪流行性腹泻病毒变异株、经典毒株和弱毒疫苗株的多重RT-PCR鉴别检测方法。

基于以上的研究和当前的需求，本研究根据PEDV弱毒疫苗株ORF3基因缺失49个核 苷酸以及变异毒株S基因连续的核苷酸插入的特征，设计并合成了2对检测猪流行性腹泻 病毒的引物，采用多重RT-PCR方法扩增ORF3基因和S基因片段，通过扩增片段的数量和分子 量大小，判断是猪流行性腹泻病毒变异株、经典毒株还是猪流行性腹泻病毒弱毒疫苗株，从 而特异、敏感、快速简便、低成本、有效的鉴别诊断猪流行性腹泻病毒的毒株类型。

发明内容

本发明的目的为建立猪流行性腹泻病毒（PEDV）变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株 快速鉴别检测方法，降低成本，并能快速、有效的检测出猪流行性腹泻病毒的三种毒株，提 供一种猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测试剂盒。为实现本发明目的所使用的技术方案 为：

一种猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括以下引物序列：

ORF3-F5’-gcgcgttttgctgtcat-3’（SEQID1），

ORF3-R5’-gtcaccaccttctaaaatcac-3’（SEQID2）；