[发明专利]一种菌渣培养促中国被毛孢产分生孢子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种菌渣培养促中国被毛孢产分生孢子的方法。

技术背景

冬虫夏草是冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis)感染并寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上长出的子座(子实体)及幼虫虫体的复合体，属于可食用的真菌，是我国一种传统的名贵滋补中药材，有调节免疫系统功能、抗肿瘤、抗疲劳等多种功效。

野生的冬虫夏草仅生长在青藏高原海拔3000-5000米的高山草甸、高原草甸等高寒植被中，由于近年来过度采挖，使得虫草资源已经濒临灭绝。而另一方面随着人们生活水平的提高，对冬虫夏草的需求却越来越高，冬虫夏草人工培育成为解决这一问题的有效途径之一。因此，我国科研人员一直在进行利用冬虫夏草菌侵染蝙蝠蛾幼虫人工培植冬虫夏草来替代野生冬虫夏草的产业化研究。冬虫夏草要完成产业化，首先必须找到它正确的菌种，然后利用冬虫夏草菌来侵染蝙蝠蛾幼虫，进而培植出冬虫夏草。经过多年的研究，冬虫夏草菌被鉴定为中国被毛孢，又称为蝙蝠蛾被毛孢。

人工培植冬虫夏草主要是采用中国被毛孢的菌丝体来侵染蝙蝠蛾幼虫，但是这种常规侵染方法的侵染率不高，使得培植冬虫夏草的成功率受到影响，阻碍了冬虫夏草的产业化发展。随着对人工培植冬虫夏草技术领域的不断探索，有研究表明采用中国被毛孢的分生孢子来侵染蝙蝠蛾幼虫能够明显提高侵染率。因此，人工制备中国被毛孢菌分生孢子的过程就成为影响人工培植冬虫夏草成功率的重要环节。

目前，有关中国被毛孢产生分生孢子的报道较少，且分生孢子的数量不高。如文献“不同因子对冬虫夏草真菌产生分生孢子的研究”(李玉玲，《食用菌》2002年第5期)，其论述了中国被毛孢在不同培养基、不同光照以及不同温度下产生分生孢子的研究；又如文献“不同微量元素和生长因子对冬虫夏草分生孢子产量的影响”(李玲玲，罗合春，胡敏，《重庆工贸职业技术学院学报》2014年第2期)，其通过在基础培养及配方中添加微量元素和氨基酸生长因子，研究了不同微量元素和生长因子对中国被毛孢孢子产量的影响，但是利用上述文献中的方法所得到的分生孢子数量不高于10⁵数量级。因此，如何通过培养获得大量分生孢子，已逐渐成为人工培植冬虫夏草产业化发展过程中的瓶颈。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足，提供一种菌渣培养促中国被毛孢产分生孢子的方法，在分生孢子诱导阶段选用一定种类的光源进行光周期刺激培养，该方法获得分生孢子的周期短且产量高。

本发明的技术方案提供了一种菌渣培养促中国被毛孢产分生孢子的方法，包括以下制备步骤：

(1)菌种选择：收集冬虫夏草子囊孢子，挑取单子囊孢子进行培养，得到中国被毛孢单子囊孢子菌落；

(2)菌渣获得：在菌落中挑取3-5块菌块接种于培养基中，将菌块打碎，于恒温摇床中培养10天，记为一级摇瓶；将一级摇瓶进行扩培，在相同培养条件下培养5天，记为二级摇瓶；将二级摇瓶进行扩培，在相同培养条件下培养5天，记为三级摇瓶；将获得的三级摇瓶进行菌液分离，获得的菌丝体即为菌渣；

(3)菌渣生长：将菌渣分装于无菌广口瓶中，底部垫上吸水棉，封好瓶盖，放置于恒温培养箱中培养生长；

(4)分生孢子诱导：待菌渣表面布满气生菌丝后，在一定温湿度下光周期刺激培养进行分生孢子诱导，诱导一定时间后得到大量散落的分生孢子；

所述光周期刺激培养为光照培养12小时，黑暗培养12小时；其中，光照的光源选自蓝光、红光、或蓝光与红光的组合。

分生孢子是微生物对于特定条件下的一种应急反应，可以理解为不利环境下，微生物为了不使自身的种属被灭绝而产生的一种更为稳定、耐受性更强的无性繁殖体，因此特定的培养基以及培养条件相互协调才能制备得到大量的分生孢子。申请人在对中国被毛孢生长发育特点深入研究的基础上，经过创造性的劳动，提供了一种菌渣培养促中国被毛孢产分生孢子的方法，本发明所述方法分为菌种选择、菌渣获得、菌渣生长和分生孢子诱导四个阶段。

本发明中选用冬虫夏草单子囊孢子作为菌种，相对于其他组织分离的菌种具有稳定性好、活力强、特别是发酵出来的菌丝体量多的优点，通过对菌丝多级扩培，能够极大的提高分生孢子的数量。

本发明中所述菌渣获得阶段，在一些实施方式中，所述摇瓶培养基的配方，由以下质量百分比的组分组成：蚕蛹粉0.5％，蛋白胨0.5-1.5％，酵母粉1-2％；葡萄糖2-4％，无水硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，七水硫酸锌0.0013％，天门冬氨酸0.1％，维生素C 0.1％，纯牛奶8％。