[发明专利]一种检测牛冠状病毒的引物、探针、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，更具体地，本发明涉及一种检测牛冠状 病毒的引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术

牛冠状病毒(bovinecoronavirus,BCV)是引起成年牛冬痢和新生犊牛腹泻 (腹泻粪便中常带有血液和粘液)的最主要的病原之一，BCV的感染在全世界 各国广泛分布。美国科学家Mebus等人(MebusCA,StairEL,RhodesMB,etal. Pathologyofneonatalcalfdiarrheainducedbyacoronavirus-likeagent[J].Vet Pathol,1973,10:45-64.)在发病的犊牛和成年牛的粪便病料中检出了BCV病毒， 随后世界其他国家也报道了该病的发生。我国学者宋广林等人(宋广林，董惠 兰，滕庆，等.犊牛流行性腹泻病原研究[J].畜牧兽医学报,1985,16:121-122.) 于1985年首次报道了BCV在中国的存在，随后我国各地均有报道(傅彩霞， 靳兴军，郑瑞峰，等.北京地区规模化奶牛场三种病毒性腹泻病的血清学调查[J]. 动物医学进展，2012.33(5):85-88)。

BCV在我国已有多次暴发，对新生犊牛造成较高的死亡率。快速诊断此病 是有效降低损失的重要手段。

目前，常用的牛冠状病毒检测方法有：(1)Elisa抗体检测方法:它的原理 是牛感染牛冠状病毒后产生抗体，通过抗体的检测确定是否感染牛冠状病毒； (2)病毒的分离纯化方法：通过对病毒的细胞培养纯化，确定是否感染牛冠状 病毒。

现有方法存在以下缺点：(1)Elisa抗体检测方法：该法的前提是牛感染牛 冠状病毒并产生抗体，由于从感染病毒到产生抗体需要一定的时间，这对病毒 的检测在时间上有一定的局限性，不能及时准确的检测到牛冠状病毒；另外， 免疫过牛冠状病毒疫苗，或者之前感染过牛冠状病毒的牛，后续抗体会在一定 时间内持续存在，即使当牛体内没有病毒时也会检测到抗体，抗体检测结果阳 性也无法说明牛体内是否存在牛冠状病毒。(2)病毒的分离纯化方法：该法为 经典的病原学诊断方法，但操作起来费时费力，牛冠状病毒的分离培养一般较 为困难，尤其是初次的分离培养。因此，病毒分离纯化法也不能很好的满足现 代化养殖快速有效的病原学检测需要。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明在牛冠状病毒N基因处设 计定量PCR引物，并采用探针法建立荧光定量PCR方法，提供了一种检测牛冠 状病毒的引物、探针、试剂盒及方法。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种检测牛冠状病毒的引物，所述引物如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所 示。

上述检测牛冠状病毒的引物在制备检测牛冠状病毒的试剂盒中的应用。

一种检测牛冠状病毒的探针，所述探针如SEQIDNO:3所示。

在其中一些实施例中，所述探针的3’端结合有荧光淬灭基团TAMRA，5’ 端结合有荧光报告基团FAM。

一种检测牛冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物和探针。

一种检测牛冠状病毒的方法，采用上述的引物和探针，包括以下步骤：

以待测样本的RNA反转录得到的cDNA作为模板，进行荧光定量PCR扩 增，比较扩增曲线CT值；

其中，所述荧光定量PCR的扩增体系为：q-pcrMix酶10μL，引物SEQID NO:1和SEQIDNO:2各0.2μL，SEQIDNO:3探针0.1μL，分子生物学用水7.46 μL，Rox参比染料0.04μL，cDNA模板2μL；

所述荧光定量PCR的扩增反应程序为：50℃2min；95℃2min，95℃3s， 60℃30s，40个循环。

在其中一些实施例中，所述反转录包括如下步骤：

(1)、将RNA加入到预混液1中，混合均匀后，65℃保温5min后迅速冰上 急冷3min，所述预混液1的配方为：50μM的RandomPrimer1μL，10mMeach 的dNTPMixture1μL；