[发明专利]一种鉴定烟草品种纯度的分子生物学方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物品种纯度的鉴定方法，特别涉及一种采用基因组测序与序列比较对烟草品种纯度进行准确鉴定的分子生物学方法，属于烟草分子生物学技术领域。

背景技术

品种纯度（varietalpurity）是指一批种子中（或良种繁殖田块中）个体与个体之间在特征、特性方面典型一致的程度，即本品种的种子数（株、穗数）占供检本作物（种）样品数的百分率。中华人民共和国烟草行业标准烟草种子检验规程（YC/T20-1994）规定了的纯度要求，原种要求纯度不低于99.9%，一级良种不低于99.5%，二级良种不低于99.0%。

种子的真实性和纯度是评价种子质量优劣的重要指标。烟草品种纯度的下降将导致烟叶产量和质量的明显降低，比如上部叶开片不佳、株型变化、有效叶数减少、节距缩短、品质下降及病虫害抗性降低等，严重影响烟叶产业和烟农的经济效益，对烟叶生产安全构成重大威胁。鉴于此，目前，生产上主要采取了以下五种有效措施提高纯度：（1）防止机械混杂。（2）严格隔离措施，防止生物学混杂。（3）对原种进行提纯，防止品种本身遗传特性改变。（4）防止自然突变。（5）正确人工选择。

目前，鉴定品种纯度的方法主要以下四种：（1）种子形态鉴定法。主要根据种子的形态特征如大小、形状、颜色、光泽、种皮纹路等鉴定。（2）幼苗形态鉴定法。主要根据幼苗的整体形态、外部构造、根系、叶片出现数量（分单子叶和双子叶）、子叶出土/留土类型、幼苗缺陷等评估种子纯度。（3）田间小区种植鉴定法。根据严格设置的田间试验和执行一致的田间管理，找出不符合本品种典型性状或具有显著变异的植株，计算出纯度。（4）分子标记鉴定法。利用常用分子标记如：RFLP、RAPD、AFLP、SRAP、SSR和InDel标记对一定数量样本逐一进行检测，统计存在于对照与待检材料之间的分子标记多态性的样本数量，计算出纯度。其中，综合标记开发费用与鉴定效果，SSR标记使用最为广泛，比如发明专利“一种快速鉴定油葵新葵19号品种纯度的试剂盒（CN104164513B）”、“一种基于EST-SSR标记的甜瓜杂交种种子纯度鉴定的方法（CN104059992B）”、“一种基于EST-SSR标记的龙眼杂交后代纯度鉴定方法（CN103627799B）”等均使用了SSR分子标记，也有使用其他标记鉴定品种纯度的发明专利“分子标记技术在快速鉴定杂交稻种真伪和纯度方面的应用（CN1110248C）”等。上面前三种纯度鉴定方法属于宏观的表型鉴定，结果的准确性受人、季节、气候等环境因素影响较大，第四种方法属于微观的内在遗传物质鉴定，不受环境因素影响，准确性大大提高，但该方法也只能根据分子标记进行PCR扩增出来的DNA片段长度或有无多态性差异来判断品种差异和纯度高低，却无法检测出碱基作为遗传物质最小单位的差异，换言之，常常存在个别碱基差异的品种无法用上述分子标记检测出来，因此，开发出能从碱基这个最小遗传单位水平上鉴定品种纯度的方法显得非常必要。

2010年，中国烟草基因组计划正式启动，2013年底国家烟草基因研究中心获得了烟草全基因组参考序列，这为本发明中烟草品种基因组重测序序列的拼接、组装和比较提供了序列参考模板，大大节约了时间，降低了开发成本。

发明内容

本发明为解决现有技术的不足提供一种鉴定烟草品种纯度的新方法，具体为一种鉴定烟草品种纯度的分子生物学方法，可从最小遗传单位的碱基水平上鉴定烟草品种纯度，较宏观表型类和微观类的分子标记鉴定方法更准确、更能反映本质差异，大大提高烟草品种纯度鉴定结果的精确性，可作为烟草品种纯度鉴定的“终审结果”，不受环境条件影响，对保证烟叶生产用种安全、促进烟叶产业发展、保障烟农经济利益及解决烟草品种知识产权纠纷意义重大。

所述一种鉴定烟草品种纯度的分子生物学方法，其特征在于具体步骤依次如下：

A、将对照与待检烟草品种种子分别播种于已标识的营养钵中，置于光照培养架上培养，24小时内辅助灯光设计为开灯8~10小时，关灯14~16小时，室内温度保持在25~28℃，根据营养钵中营养土干湿情况补充水分；

B、待烟苗长出7~10片真叶后，随机选取数量相等的对照与待检烟草品种烟苗，每株烟苗采集1~3片真叶，采用CTAB小样法提取和纯化基因组总DNA，将每份DNA浓度调至相同，一般为100~200ng/μl，对照烟草品种各烟苗DNA等量混合构建成为对照DNA混合池，待检烟草品种各烟苗DNA等量混合构建成为待检DNA混合池，-20℃保存备用；