[发明专利]FVIII的位点定向修饰

说明书

本申请是申请日为2005年11月14日、申请号为201310125428.4、发明名称为“FVIII的位点定向修饰”的PCT申请的分案申请。

与相关申请的交叉参考

本申请要求享有2004年11月12日提交的美国专利申请系列号60/627,277的优先权利益，其在这里整体引作参考。

技术领域

本发明涉及因子VIII(FVIII)突变蛋白，其允许在确定的位点偶联一个或多个生物相容的聚合物如聚乙二醇。另外，提供了用于治疗目的的相关的制剂、其剂量及施用方法。这些修饰的FVIII变体和相关的组合物和方法用于给遭受血友病A的个体提供具有减少的注射频率和减少的免疫原性应答的治疗选择。

背景技术

血友病A是最常见的遗传性凝结障碍，估计的发病率为1/5000男性。它的原因是FVIII的缺乏或结构缺陷，所述FVIII是血液凝结的固有途径中的关键组分。目前血友病A的治疗包含静脉内注射人FVIII。已经重组地生产了人FVIII，作为约300kD的单链分子。它由结构域A1-A2-B-A3-C1-C2组成(Thompson，2003，Semin.Hematol.29，pp.11-22)。前体产物在高尔基体中被加工成200kD(重链)和80kD(轻链)的2条多肽链，这2条链通过金属离子结合到一起(Kaufman等，1988，J.Biol.Chem.263，p.6352；Andersson等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.83，p.2979)。

FVIII的B-结构域似乎是可有可无的，因为还已经显示B-结构域缺失的FVIII(BDD，90kDA1-A2重链+80kD轻链)可以有效地用作血友病A的替补疗法。B-结构域缺失的FVIII序列含有B-结构域的14个氨基酸以外的所有缺失。

目前，通过根据需要静脉内施用FVIII来治疗血友病A患者，或者作为预防疗法每周施用几次。关于预防治疗，每周施用15-25IU/kg体重的因子VIII3次。患者总是需要它。因为它在人中的半衰期短，所以必须频繁地施用FVIII。尽管全长蛋白具有大于300kD的大尺寸，但FVIII具有仅约11小时的人中的半衰期(Ewenstein等，2004，Semin.Hematol.41，pp.1-16)。对频繁的静脉内注射的需要造成患者顺应性的巨大障碍。如果可以开发具有更长的半衰期且因而需要更低频率的施用的FVIII产物，则会更方便患者。另外，如果提高了半衰期，那么由于需要更低的剂量，可以降低治疗费用。

现有疗法的另一个缺点是，约25-30％患者发展抑制FVIII活性的抗体(Saenko等，2002，Haemophilia8，pp.1-11)。抑制性抗体的主要表位定位于A2结构域中的残基484-508、A3结构域中的残基1811-1818和C2结构域。抗体发展阻止FVIII作为替补疗法的应用，迫使该组患者寻求使用高剂量重组因子VIIa的甚至更昂贵的治疗和免疫耐受疗法。

下面的研究鉴别出了抑制性抗体的FVIII表位。在25份抑制性血浆样品的研究中，发现11份结合凝血酶产生的73kD轻链片段A3C1C2，4份结合A2结构域，且10份结合二者(Fulcher，C.等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.2(22)，pp.7728-32)。在另一项研究中，重组A2多肽中和了8种来自患者的A2结构域抑制剂中的6种(Scandella，D.等，1993，Blood82(6)，pp.1767-75)。将9种来自患者的抑制剂中的6种的表位作图到A2残基379-538(Scandella，D.等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.85(16)，pp.6152-6)。18种重链抑制剂的表位定位于相同的A2结构域N-末端18.3kD区域(Scandella，D.等，1989，Blood74(5)，pp.1618-26)。