[发明专利]一种耐盐性蛋白酶的提取及缩短鱼露发酵时间的应用方法

权利要求书

1.一种耐盐性丝氨酸类蛋白酶的提取方法，其特征在于，利用从鱼露发酵液中筛选出的产耐盐性蛋白酶的橘青霉菌菌株PenicilliumcitrinumYL-1经发酵得到粗酶液，再经硫酸铵沉淀、透析和DEAEcellulose-52离子交换柱层析而得到。

2.根据权利要求1所述一种耐盐性丝氨酸类蛋白酶的提取方法，其特征在于，所述产耐盐性蛋白酶的橘青霉菌菌株PenicilliumcitrinumYL-1由包括以下步骤的方法筛选得到：

（1）按以下重量份的配比配制分离培养基：马铃薯200份，葡糖糖20份，NaCl100份，琼脂20份；

（2）取鱼露发酵液用无菌水中稀释10倍，依次按十倍级差稀释，取不同的稀释度样液，分别涂布分离培养基培养的分离平板，同一稀释度重复三个平板，然后倒置于30℃培养箱中培养，每隔24h观察一次；

（3）采用平板透明圈法进行菌株初筛，所用培养基为含脱脂乳的固体培养基，初步筛选出产蛋白酶菌株；

（4）将步骤（3）分离得到的霉菌菌株选择生长良好、形态明显的单菌落，点种于脱脂乳培养基上，30℃培养5d后，通过其水解圈筛选产蛋白酶菌株，接种到斜面培养基上于30℃培养，待菌长好后放入4℃冰箱冷藏。

3.根据权利要求1所述的耐盐性丝氨酸类蛋白酶的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、按重量百分比KH₂PO₄0.2%、MgSO₄·7H₂O0.2%,NaCl10%混合配成1000mL液体基础培养基，调pH至5.5，然后每只250mL三角瓶中称取6g干麸皮，加入9mL液体培养基混匀，用121℃，20min高温湿热灭菌，得固体基础培养基；

b、取孢子密度为10⁶个/mLPenicilliumcitrinumYL-1菌株孢子悬浮液加入到基础固体培养基上，混和均匀后30℃静置培养，将发酵结束后的固体产酶培养基中加入0.1mol/LNaCl溶液，捣碎并搅拌均匀，30℃摇床震荡1h，然后用纱布过滤，滤液在4℃条件下，5000r/min离心5min，取上清液，上清液即为粗酶液；

c、在4℃条件下，粗酶液中加入硫酸铵，使其成为硫酸铵的饱和溶液，12000r/min离心20min，弃上清液，收集沉淀，用0.01mol/LpH7.0磷酸缓冲液溶解沉淀，得到盐析后的蛋白酶溶液，然后进行透析；

d、将透析脱盐浓缩的蛋白酶样品，利用DEAE52-Cellulose离子交换柱层析进一步分离纯化，层析柱是用0.01mol/LpH7.0磷酸缓冲液线性梯度洗脱出来，收集具有酶活性的洗脱峰部分，合并，冷冻干燥，得到耐盐性丝氨酸类蛋白酶酶粉。

4.根据权利要求3所述的耐盐性丝氨酸类蛋白酶的提取方法，其特征在于，步骤b中，所述0.1mol/LNaCl溶液的加入量与基础固体培养基的体积质量配比为100ml：10-20g。

5.根据权利要求3所述的耐盐性丝氨酸类蛋白酶的提取方法，其特征在于，步骤c中，所述硫酸铵最佳的饱和度为80%。

6.根据权利要求3所述的耐盐性丝氨酸类蛋白酶的提取方法，其特征在于，步骤c中，所述沉淀温度为4℃，时间24h以上，离心分离转速12000r/min，时间20min。

7.一种耐盐性蛋白酶缩短鱼露发酵时间的应用方法，其特征在于，包括：将耐盐性丝氨酸类蛋白酶以体积比为1:3-5的比例添加到自然发酵6个月鱼醪中，然后加入食盐使鱼露发酵液维持饱和状态，搅拌均匀，酶反应温度35-45℃，发酵12-16天，将发酵液过滤。

8.根据权利要求7所述的耐盐性蛋白酶缩短鱼露发酵时间的应用方法，其特征在于，所述耐盐性丝氨酸类蛋白酶与鱼醪的体积比为1:4，发酵温度40℃，发酵时间15天。