[发明专利]一种耐盐性蛋白酶的提取及缩短鱼露发酵时间的应用方法

说明书

技术领域

本发明涉及到酶工程技术领域，具体涉及到一种耐盐性丝氨酸类蛋白酶的提取并利用其缩短鱼露发酵时间的方法。

背景技术

鱼露是我国传统水产调味品，是以经济价值较低的鱼虾及水产品加工的下脚料为原料，主要利用鱼体自身含有的蛋白酶及其他酶，以及在多种耐盐和嗜盐微生物在一定条件下共同作用所形成的。但目前我国鱼露的传统工艺生产周期较长，生产成本高，生产缺乏完善的质量评估与控制体系，其生产工艺与技术也有待于改进。而且在天然环境下，鱼体分解较慢，一般添加饱和食盐，这种高盐环境抑制腐败微生物生长。因此，在高盐环境下缩短发酵时间，进行快速发酵一直是鱼露发酵工艺的研究重点。

国内外对鱼露的快速发酵的研究除保温发酵、外加酶发酵及复合发酵外，一些研究员将目光集中在鱼露发酵液中的微生物筛选及应用。泰国学者在2008年又从发酵一个月的泰国鱼露中分离到virgibacillussp.SK33（Sinsuwanetal.,2008）。日本研究者2004年从越南鱼露中分离出能在大豆蛋白胨培养基上生长的大量的碱性蛋白酶的菌株BacillussubtilisCN2（Uchidaetal.,2004）。在国内，研究学者从自制发酵3个月的鱼露中筛选出具有降解生物胺能力的菌株奥默柯达酵母M8（杨利昆等，2012）；而且从传统发酵的潮汕鱼露中分离出乳酸菌（张豪等，2013）。目前越来越多的学者从鱼露中分离得到一些嗜盐性的和耐盐性的微生物包括Bacillussp.,Pseudomonassp.,Filobacillussp.,Micrococcussp.,Staphylococcussp.,Virgibacillussp.,Halobacillussp.,Halococcussp.,H.salinarum,Halobacteriumcutirubrum，H.salinarium（KawasakiFukamietal.,2004；Akolkaretal.,2010；Lopetcharatetal.,2001；Namwongetal.,2006；Hiragaetal.,2005）。今后鱼露快速发酵的另一个研究重点是从传统鱼露的发酵过程中分离筛选出耐盐和嗜盐高产蛋白酶微生物，鉴定其蛋白酶的性质，并进行鱼露快速发酵的研究，找到既能显著缩短鱼露发酵周期，又能产生良好风味的菌种，并使其能应用于大规模的工业生产。但是目前仍未见耐盐和嗜盐高产蛋白酶微生物应用到实际生产中取得较好效果的报道，更鲜有报道Penicilliumcitrinum及所产的耐盐性蛋白酶。

发明内容

本发明的目的在于提供耐盐性丝氨酸类蛋白酶的提取方法及其添加到鱼露发酵中可缩短发酵时间的应用，其采用从鱼露发酵液中筛选的产耐盐性蛋白酶的橘青霉菌菌株，经固态发酵提取得到耐盐性丝氨酸类蛋白酶，其具有较好的耐盐性，用于鱼露发酵可以缩短发酵时间，而且风味与自然发酵的鱼露高级产品的风味相似，不会产生不良风味。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种耐盐性丝氨酸类蛋白酶的提取方法，是利用从鱼露发酵液中筛选出的PenicilliumcitrinumYL-1进行发酵，得到的粗酶液再经硫酸铵沉淀、透析和DEAEcellulose-52离子交换柱层析而得到。所述PenicilliumcitrinumYL-1的筛选方法包括以下步骤：

（1）按以下重量份的配比配制分离培养基：马铃薯200份，葡糖糖20份，NaCl100份，琼脂20份；

（2）取鱼露发酵液用无菌水中稀释10倍，依次按十倍级差稀释，取不同的稀释度样液，分别涂布分离培养基培养的分离平板，同一稀释度重复三个平板，然后倒置于30℃培养箱中培养，每隔24h观察一次；

（3）采用平板透明圈法进行菌株初筛，所用培养基为含脱脂乳的固体培养基，初步筛选出产蛋白酶菌株；

（4）将分离得到的霉菌菌株选择生长良好、形态明显的单菌落，点种于脱脂乳培养基上，30℃培养5d后，通过其水解圈筛选产蛋白酶菌株，接种到斜面培养基上于30℃培养，待菌长好后放入4℃冰箱冷藏。

更为具体的实施方案为：一种耐盐性丝氨酸类蛋白酶的提取方法，包括以下步骤：

a、按重量百分比KH₂PO₄0.2%、MgSO₄·7H₂O0.2%,NaCl10%混合配成1000mL液体基础培养基，调pH至5.5，然后每只250mL三角瓶中称取6g干麸皮，加入9mL液体基础培养基混匀，用121℃，20min高温湿热灭菌，得基础固体培养基；