[发明专利]P1NP检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于医疗器械领域，具体地是涉及一种人血清或血浆中I型胶原氨基端延长肽(P1NP)检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

I型胶原前肽(P1NP)是最常见的骨胶原，是骨基质的重要组成部分，几乎占总蛋白部分的90％。在骨中的胶原是由成骨细胞以前胶原的形式合成的，前胶原形成胶原纤维时从前胶原分子上裂解产生前胶原氨基端肽(P1NP)，因此，测定其在血中的水平，可反映骨形成情况。

P1NP反映的是I型胶原的沉积情况，因此是作为一项骨形成标志物。在I型胶原的形成过程中，P1NP被释放至细胞外间隙最终进入血液。所以，血清中I型胶原前肽水平在一定范围内是反映成骨细胞活动和骨形成以及反映I型胶原合成速率的特异指标。

另一方面，现有的检测手段存在诸多缺陷：检测成本较高，使用不方便，无法实现快速检测，测试的灵敏度也比较低。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种人血清或血浆中I型胶原氨基端延长肽试剂盒。

实现上述目的技术方案如下：

一种人血清或血浆中I型胶原氨基端延长肽(P1NP)检测试剂盒，主要包括：

1)包被有链霉亲和素的微孔板，每个微孔包被的链霉亲和素量为0.24－0.36μg；

2)生物素标记的鼠抗P1NP单克隆抗体溶液，其中P1NP单克隆抗体的浓度为0.8－1.2μg/ml，用量为每微孔100μl；

3)HRP标记的鼠抗P1NP单克隆抗体溶液，其中HRP标记的鼠抗P1NP单克隆抗体的工作浓度为1:2500-3000。

在其中一个实施例中，每个微孔包被的链霉亲和素量的为0.3μg。

在其中一个实施例中，生物素标记的鼠抗P1NP单克隆抗体得浓度为1.0μg/ml。

本发明另一目的是提供一种P1NP检测试剂盒的制备方法。

实现上述目的的技术方案为：

一种P1NP检测试剂盒的制备方法，主要包括以下步骤：

1)包被有链霉亲和素的微孔板：

向每个微孔板的微孔中加入80－120μl浓度为3μg/ml的链霉亲和素，37±2℃干燥，密封保存，洗板，封闭；

2)制备生物素标记的鼠抗P1NP单克隆抗体溶液：将鼠抗P1NP抗体用PBS缓冲液和EDTA稀释至终浓度为2mg/ml，然后加入NH₂-ReactiveBiotin使体积为0.5ml，轻轻混匀后置于37±2℃恒温箱中避光温育，离心，再用10mmol/L的PBS缓冲液和25mol/L的EDTA稀释至终浓度为0.8－1.2μg/ml。

优选地，所述每个微孔中加入链霉亲和素的量为100μl。

优选地，所述微孔板的洗板和封闭为：加入链霉亲和素的次日，弃去孔内液体，加入洗涤液280-300ul/孔，漂洗3次，每次3min；按200-250ul/孔加入封闭液，37±2℃封闭1-2小时或在4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液。

所述P1NP检测试剂盒还包括有HRP标记的鼠抗P1NP单克隆抗体，该HRP标记的鼠抗P1NP单克隆抗体抗体的制备操作为：

1)取鼠抗P1NP单克隆抗体冻干粉0.1g，与10ml浓度为10mmol/L的PBS缓冲液混合；

2)取HRP干粉用去离子水稀释为5mg/ml，采用简易过碘酸钠法将HRP与抗体交联；

3)取制备后的HRP标记的鼠抗P1NP单克隆抗体，用10mmol/L的PBS缓冲液和25mol/L的EDTA稀释，稀释后的HRP标记的鼠抗P1NP单克隆抗体的工作浓度为1:2500－3500，加入防腐剂和稳定剂后保存。

所述鼠抗P1NP单克隆抗体的制备为：取6只小白鼠，采用皮下注射方式进行免疫接种，初次免疫注射1mg/mLP1NP抗原0.2ml/只，第3周、第4周及第5周注射1mg/mLP1NP抗原与不完全弗氏佐剂等体积混合溶液0.4ml/只；第5周后取血检测效价，若大于1：10000，则拉颈处死小鼠后取脾脏，然后采用杂交瘤技术制备单克隆抗体。

所述P1NP检测试剂盒采用酶联免疫法，基于抗P1NP抗体对可溶性P1NP抗原双抗夹心法检测原理设计。所述P1NP检测试剂盒具有特异性、灵敏度和精密度都非常好的优点。

具体实施方式