[发明专利]用于鱼类肠道益生菌候选菌株耐受力检测的样品前处理方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，具体说，是一种用于鱼类肠道益生菌候选菌株耐 受力检测的样品前处理方法。

背景技术

对鱼类肠道益生菌候选菌株进行体外耐受力检测是评估其是否具有在鱼 类肠道中存活、定植潜在能力的重要方法。目前耐受力检测方法一般包括胆 盐耐受性试验、耐渗透压试验、耐酸试验等。具体样品处理方法是应用胆盐、 氯化钠、胆酸等生化试剂配制不同浓度的工作液，将候选菌株菌液置于这些 工作液中孵育。利用平板菌落计数法计数孵育后菌液单位体积的菌落形成单 位(CFU)，然后根据CFU大小来判定候选菌株耐受力。

目前市场上没有鱼源胆盐、胆酸等产品销售，在鱼类肠道益生菌候选菌 株耐受力检测过程中，胆盐耐受性试验、耐渗透压试验、耐酸试验所用到的 生化试剂如胆盐、胆酸等往往来源于哺乳动物，经过一系列物理、化学方法 处理提纯得到。由于鱼类生理特征、生活环境的特殊性，以及鱼类肠道环境 的复杂性，人工配制的这些生化试剂溶液并不能反映鱼类肠道内环境特点。 利用这些市售生化试剂对样品进行处理，常常导致鱼类肠道益生菌候选菌株 耐受力检测结果可靠性不强。所以目前急需一种适用于鱼类肠道益生菌候选 菌株耐受力检测的样品处理方法，来模拟益生菌候选菌株在鱼类肠道环境中 的生存状态。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种利用鱼类胆囊胆汁代替市售生 化试剂的用于鱼类肠道益生菌候选菌株耐受力检测的样品前处理方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于鱼类肠道 益生菌候选菌株耐受力检测的样品前处理方法，包括以下步骤：

1)将鱼置于流水养殖系统中，禁食48-96小时，挑取健康鱼，体表消毒 后，掀开体壁，暴露鱼的胆囊，用无菌磷酸盐缓冲液冲洗胆囊部位的血液、 脂肪；

2)用一次性注射器针头刺破胆囊，抽取胆汁3-10ml，然后用无菌磷酸 盐缓冲液稀释胆汁至体积百分比浓度为5-20％，保存于-20℃冰箱备用；

3)取100μL待测菌株菌液加入到10ml液体培养基中，在30-37℃恒温 培养箱中培养48小时，然后将菌液OD值在625nm波长调节至0.1；

4)取500μL的菌液，4000rpm，4℃，离心5min，收集菌体，加入500 μL步骤2)制得的含有体积百分比浓度为5-20％鱼胆汁的磷酸盐缓冲液， 在30-37℃恒温培养箱中孵育1-2小时。

所述步骤1)为将体重为200-1200g健康鱼置于流水养殖系统中，禁食 48-96小时，然后挑取健康鱼，用体积百分比浓度为75％乙醇擦拭体表，用 钝头剪刀自肛门向脊柱方向剪开体壁，避开腹腔内组织，剪刀头上挑，防止 损伤组织，剪至鳃盖后缘后，再沿鳃盖后缘剪至下颌，掀开体壁，暴露鱼的 胆囊，用无菌磷酸盐缓冲液冲洗胆囊部位的血液、脂肪。

所述无菌磷酸盐缓冲液的配比为：1000ml去离子水中含有磷酸二氢钾 0.24g，磷酸氢二钠1.44g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g。

本发明的有益效果是：本发明利用鱼类胆囊胆汁代替市售生化试剂对鱼 类肠道益生菌候选菌株进行处理，用于检测其耐受力。鱼类禁食后，胆汁储 存于胆囊，胆囊胆汁取出进行稀释后可直接使用，也可保存于-20℃冰箱备用， 能够节省配制不同生化试剂溶液的时间，而且利用鱼类胆囊胆汁液处理待测 菌株的方法能够更准确模拟待测菌株在肠道内的生存状态。本发明中的样品 处理方法取材方便，操作简单易行，经济环保，结果稳定可靠，可适用于不 同鱼类肠道益生菌或候选菌株的耐受力检测。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

本发明用于鱼类肠道益生菌候选菌株耐受力检测的样品前处理方法，包 括以下步骤：

1)将鱼置于流水养殖系统中，禁食48-96小时，挑取健康鱼，体表消毒 后，掀开体壁，暴露鱼的胆囊，用无菌磷酸盐缓冲液冲洗胆囊部位的血液、 脂肪；

2)用一次性注射器针头刺破胆囊，抽取胆汁3-10ml，然后用无菌磷酸 盐缓冲液稀释胆汁至体积百分比浓度为5-20％，保存于-20℃冰箱备用；

3)取100μL待测菌株菌液加入到10ml液体培养基中，在30-37℃恒温 培养箱中培养48小时，然后将菌液OD值在625nm波长调节至0.1；