[发明专利]2型糖尿病肾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法

权利要求书

1.一种2型糖尿病肾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其特征在于，包括 以下步骤：

(1)样品收集；

(2)样品预处理：收集的唾液样品在2h内置于转速3000r/min的4℃低温离心机离心 10min，并按照50μl/管分装于冻存管，置于-80℃冰箱冷冻保存备用；

(3)纳米磁珠活化；

(4)唾液样品上样：④取5μl唾液样品，加10μl的U9裂解液，混合孵育30min后，加入185μ l的WashBuffer稀释；⑤向含有活化磁珠的PCR管中加入100μl处理好的唾液样品，室温孵 育30min，置于磁铁上孵育1min，去除上清液；⑥再往管中加入100μl的WashBuffer洗脱 5min，然后将PCR管置于磁铁上孵育1min，去除上清液；⑦重复步骤⑥一次；

(5)纳米磁珠洗脱：每个PCR管中加入10μl的ElutionBuffer，洗脱5min，放置于磁铁上 孵育1min，取5μl上清液移至另一个PCR管中，并加入5μl的CHCA饱和溶液充分混匀，吸取2μl 混合溶液加样到Au/Steel芯片上，风干，然后上机读取芯片，收集数据；

(6)数据采集；

(7)数据分析；

(8)建立诊断模型：采用决策树算法计算出多个变量变化对两样本的判别价值，确定诊 断模型。

2.如权利要求1所述的2型糖尿病肾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其 特征在于，步骤(1)所述样品收集方法为：2型糖尿病肾虚证组和正常对照组在取材前一天 晚上临睡前清水漱口，之后不再进食任何食物和药物，于第二天清晨起床漱口后空腹取材， 前5min内的唾液自然吞下后开始收集，收集到的唾液置于冰浴预冷的50ml具塞离心管内， 每个临床病例共采集唾液样品2-3毫升，将每个装有唾液样本的所述离心管置于冰盒里，4 ℃保存。

3.如权利要求2所述的2型糖尿病肾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其 特征在于，步骤(3)所述纳米磁珠活化方法为：①取WCX纳米磁珠50μl加入到200μl的PCR管， 置于磁铁上孵育1min，去除上清液；②再加入100μl的WashBuffer洗脱5min，在磁铁上孵育 1min，去除上清液；③重复步骤②一次。

4.如权利要求3所述的2型糖尿病肾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其 特征在于，步骤(6)所述数据采集方法为：数据采集前，用多肽标准芯片校正仪器，激光离子 流为0.5；采用质谱仪读取芯片信息，设置激光强度为190，灵敏度为5，收集数据的质荷比范 围为2000～25000m/z，信号收集位置40～60，平均每点收集20次，收集总点为100次。

5.如权利要求4所述的2型糖尿病肾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其 特征在于，步骤(7)所述数据分析方法为：所有原始数据先做总离子强度及分子量校正，使 其达到均一；对位于2000～25000m/z峰值，过滤噪音，设置初始的噪音过滤值为5，二次信噪 比为2，以10％为最小阈值进行聚类，经上述数据预处理后，采用t检验比较2型糖尿病肾虚 证组和正常对照组唾液蛋白质质谱数据，找出2组之间表达差异有统计学意义的蛋白质峰， P＜0.05为差异有统计学意义。

6.如权利要求5所述的2型糖尿病肾虚证唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其 特征在于，步骤(7)中，在质谱峰为2000～25000m/z范围内总共检测到P＜0.05的差异蛋白 峰79个，其中有9个在2型糖尿病肾虚证组和正常对照组的差异P＜0.001，有极显著意义，所 述9个差异表达蛋白质峰具体如下：