[发明专利]一种用双重复合免疫捕获RT-PCR同步检测百合隐症病毒和斑驳病毒的方法

说明书

本发明提供了一种免疫捕获双重RT‑PCR同步检测百合隐症病毒和百合斑驳病毒的方法，其步骤包括在同一个PCR反应管中用LSV和LMoV的多克隆抗体特异性捕获LSV和LMoV粒子、利用LSV和LMoV的特异性引物进行双重反转录聚合酶链式反应RT‑PCR、琼脂糖凝胶电泳检测目的片段；该方法将ELISA和RT‑PCR结合，对现有的免疫捕获RT‑PCR进行了改进，实现了用免疫捕获RT‑PCR同步检测两种百合病毒LSV和LMoV，从而完善了免疫捕获RT‑PCR技术。

技术领域

本发明涉及一种同步检测百合隐症病毒和斑驳病毒的方法，更进一步涉及一种用免疫捕获双重RT-PCR技术同步检测百合隐症病毒和百合斑驳病毒的方法。

背景技术

百合病毒自20世纪40年代被发现以来，已成为危害百合种球生产和鲜切花品质的世界性病害；至今被发现侵染百合病毒有20多种，其中百合隐症病毒(Lily symptomlessvirus，LSV)和百合斑驳病毒 (Lily mottle virus，LMoV)是发生较普遍、危害严重的2种病毒。

LSV属于香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)，是正义单链 RNA 病毒；LSV 基因组为不分段 RNA，全长为 8394 bp，5′端含帽子结构，3′端有polyA 尾巴，共有 6 个开放阅读框(ORF)，编码 4 个蛋白，依 5′至 3′分别编码：RNA 依赖的 RNA 聚合酶(RdRp)，三基因连锁结构(TGBp1-3)，外壳蛋白(CP)和核酸结合蛋白；LSV的ORF1为RdRp，编码一个蛋白(220kD)，与病毒在植物体内复制有关；ORF2、ORF3 和 ORF4 分别编码 TGBp1、TGBp2 和 TGBp3(25 kD，12 kD，7 kD)，是病毒在宿主体内运动的 3 个基因序列互相重叠的运动蛋白(MP)；ORF5为CP，编码唯一参与病毒颗粒形态构成的蛋白质(32kD)；ORF6推测是核酸结合蛋白(16kD)，该蛋白含有一个CysZ-CysZ结构的锌指结构域。

LMoV属于马铃薯Y病毒科、马铃薯Y病毒属（Potyvirus），病毒粒子为弯曲线状且呈螺旋对称，大小（650～900）nm ×（11～15）nm；病毒基因组为单分子正链RNA，约9.4kb，具有potyvirus属成员的典型基因组结构特征，包括一个Poly（A）尾巴，编码一个由3095个氨基酸组成的分子量为351.0 kDa的多聚蛋白；多聚蛋白通过自我剪切后形成外壳蛋白（CP）等10个不同大小的功能蛋白；LMoV CP亚基由274 aa组成，大小为30kDa左右，组装成外壳包裹病毒RNA。

防治百合病毒病较有效的手段是采用无毒繁殖材料或进行脱毒快繁，而这有赖于灵敏、快速和可靠的检测技术；基于病毒外壳蛋白抗原抗体反应的酶联免疫吸附法（ELISA）和基于病毒核酸的RT-PCR检测是目前较为广泛的检测病毒的方法；然而，ELISA检测一个反应体系只能完成一种病毒的检测，不能实现同步检测两种或多种病毒；RT-PCR虽然可以对两种或多种病毒实现同步检测，但是检测必须提取高质量的RNA，百合以及水仙、郁金香等球茎花卉种球富含多酚和多糖，提取的RNA中残留多酚和多糖会严重影响检测的灵敏性和特异性；免疫捕获RT-PCR或IC-RT-PCR结合了ELISA和RT-PCR另种方法的优点，具有较高的灵敏度，且更加简便高效，更重要的是不用提取RNA，检测成本低，不受多糖多酚的影响，非常适合百合、水仙、郁金香种球的病毒检测；

关于免疫捕获RT-PCR，目前已有用该方法检测多种植物病毒的相关报道，但是已建立的检测体系都仅能完成一种单一病毒的检测，至今未见用该方法同步检测两种或多种病毒的相关报道。