[发明专利]一种基于石墨烯包裹聚苯乙烯复合纳米球的无标记电化学免疫传感器的制备方法

权利要求书

1.一种基于石墨烯包裹聚苯乙烯复合纳米球的无标记电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，利用粒径为150-200nm的石墨烯包裹聚苯乙烯复合纳米球修饰电极界面固定抗体分子，制备得到无标记电化学免疫传感器，包括以下步骤：

(1)将石墨烯包裹聚苯乙烯复合纳米球超声分散于二次去离子水中，取石墨烯包裹聚苯乙烯复合纳米球悬浮液与壳聚糖溶液等体积混合并超声分散均匀；再将上述混合溶液与链霉亲和素溶液等体积混合；

(2)将玻碳电极先用氧化铝粉抛光，用二次去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉后，然后依次用乙醇和二次蒸馏水超声清洗玻碳电极，最后在氮气下吹干；

(3)取步骤(1)中制得的链霉素生物功能化的石墨烯包裹聚苯乙烯复合纳米球的混合溶液滴涂于步骤(2)中所得洁净的玻碳电极表面，并置于冷藏低温的环境下晾干；

(4)在步骤(3)所修饰后的玻碳电极表面滴涂生物素化的抗体，室温下反应后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗；

(5)将牛血清蛋白溶液滴涂于步骤(4)中所得到的玻碳电极表面，在室温下封闭后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗，得到该无标记电化学免疫传感器；

步骤(1)中，所述聚苯乙烯/石墨烯复合粒子用浓度为2.0～4.0mg/mL，壳聚糖溶液的浓度为1.0～2.0wt％，链霉亲和素的浓度为400～600μg/mL；步骤(2)中，所述的氧化铝粉粒径为0.05mm；

步骤(1)中，向乙醇水溶液加入溶有引发剂偶氮二异丁腈的苯乙烯单体，室温搅拌、N₂鼓泡后将体系温度升高至70℃，恒温恒速预反应2h，再加入甲基丙烯酰氧乙烯氯化铵，在N₂氛围下继续反应22h，将产物离心洗涤后得到聚苯乙烯球悬浮液液。将氧化石墨烯悬浮液和聚苯乙烯球悬浮液液混合超声，加入去离子水，在室温下搅拌，将体系升温至95℃，加入水合肼，回流反应，将产物离心洗涤后得到石墨烯包裹聚苯乙烯复合纳米球悬浮液，石墨烯包裹聚苯乙烯复合纳米球粒径为150-200nm。

2.如权利要求1所述的一种基于石墨烯包裹聚苯乙烯复合纳米球的无标记电化学免疫传感器制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述冷藏低温为4℃；步骤(4)中，所述生物素化的抗体浓度为1～10μg/mL。

3.如权利要求1所述的一种基于石墨烯包裹聚苯乙烯复合纳米球的无标记电化学免疫传感器制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述牛血清蛋白溶液浓度为1.0～2.0wt％。

4.一种基于石墨烯包裹聚苯乙烯复合纳米球的无标记电化学免疫分析方法，其特征在于，包括如下分析步骤：

a.将如权利要求1所述的基于石墨烯包裹聚苯乙烯复合纳米球的无标记电化学免疫传感器在抗原温育液中温育，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗；

b.以制得的该无标记电化学免疫传感器为工作电极，饱和甘汞电极作为辅助电极，铂片电极作为对电极，在铁氰化钾测试液中，用差示脉冲伏安法检测电化学信号。

5.如权利要求4所述的一种基于石墨烯包裹聚苯乙烯复合纳米球的无标记电化学免疫分析方法，其特征在于，步骤a中，温育时间为30～40min。

6.如权利要求4所述的一种基于石墨烯包裹聚苯乙烯复合纳米球的无标记电化学免疫分析方法，其特征在于，步骤b中，铁氰化钾测试液由5mM K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]和0.1M KCl混合液组成，溶液的pH为6.5，体积为10mL。