[发明专利]一种基于石墨烯包裹聚苯乙烯复合纳米球的无标记电化学免疫传感器的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫学领域和电化学分析技术领域，具体是一种基于石墨烯包裹聚苯乙烯复合纳米球的无标记电化学免疫传感器的制备方法及在肿瘤标志物中的检测技术。

背景技术

1990年，Henry等提出了免疫传感器的概念，它是将高灵敏的传感技术与特异性免疫测定技术结合起来，用于检测抗原-抗体反应的新型生物传感器。肿瘤标志物是指由肿瘤细胞产生，与肿瘤组织性质相关的物质，这些物质存在于肿瘤组织和肿瘤细胞的胞核、胞质和胞膜上或分泌在体液中。肿瘤标志物的存在或含量变化可以提示肿瘤的存在及其阶段。电化学免疫传感器将电化学分析技术和免疫测试技术相结合，因制作简单、损耗小及灵活便携等优点而备受关注是目前研究最多的较为成熟的一类免疫传感器，广泛应用于肿瘤标志物的检测。

无标记免疫分析是利用抗体与待测抗原发生特异性结合时，导致界面物理或化学性能发生变化，根据待测物浓度对该变化的影响关系实现免疫检测，相对于标记型免疫分析，极大地简化了制备和操作过程，具有操作简便，成本低廉，检测时间短等优势。

纳米材料，尤其是新型的纳米材料和纳米复合材料，由于其特殊的结构层次,具有较强的吸附能力，良好的定向能力和生物兼容性，而广泛应用于生物传感器中。石墨烯是一种只有一个碳原子厚度的二维材料，由于石墨烯的特殊结构，石墨烯表现出优异的导电性、高比表面积、电子的快速运输性、良好的机械特性、稳定的热学性以及特殊的化学性质。将石墨烯与聚苯乙烯球复合得到球状石墨烯复合材料，基于该复合纳米材料的优良性能，可以很好的应用在生物传感器领域。生物素与亲和素之间具有很强的特异性亲和作用，且一个链酶亲和素可以结合四个生物素，利用链霉亲和素将纳米结构材料进行生物功能化，将其应用在生物传感器中，可以提高灵敏度，并达到信号放大的效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于石墨烯包裹聚苯乙烯复合纳米球的无标记电化学免疫传感器的制备方法。其基本思路为：先合成石墨烯包裹聚苯乙烯复合纳米球，利用链霉亲和素将石墨烯包裹聚苯乙烯复合纳米球生物功能化并修饰于洁净的玻碳电极表面，通过链酶亲和素对生物素的特异亲和作用，将生物素化的抗体固定于功能化界面上，用牛血清蛋白封闭得到该无标记电化学免疫传感器。将制得的传感器温育抗原，抗体与抗原特异性反应形成的免疫复合物阻碍电子传递，从而引起响应电流减小，利用电信号的减小和抗原浓度直接的线性关系，可以实现对肿瘤标志物的高灵敏度无标记检测。

合成石墨烯包裹聚苯乙烯复合纳米球:

向乙醇水溶液加入溶有引发剂偶氮二异丁腈的苯乙烯单体，室温搅拌、N₂鼓泡后将体系温度升高至70℃，恒温恒速预反应2h，再加入甲基丙烯酰氧乙烯氯化铵，在N₂氛围下继续反应22h，将产物离心洗涤后得到聚苯乙烯球悬浮液液。将氧化石墨烯悬浮液和聚苯乙烯球悬浮液液混合超声，加入去离子水，在室温下搅拌，将体系升温至95℃，加入水合肼，回流反应，将产物离心洗涤后得到石墨烯包裹聚苯乙烯复合纳米球悬浮液，石墨烯包裹聚苯乙烯复合纳米球粒径为150-200nm。

制备无标记电化学免疫传感器具体包括以下步骤：

(1)将石墨烯包裹聚苯乙烯复合纳米球超声分散于二次去离子水中，取石墨烯包裹聚苯乙烯复合纳米球悬浮液与壳聚糖溶液等体积混合并超声分散均匀，再将上述混合溶液与链霉亲和素溶液等体积混合；

(2)将玻碳电极先用氧化铝粉抛光，用二次去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉后，然后依次用乙醇和二次蒸馏水超声清洗玻碳电极，最后在氮气下吹干；

(3)将链霉素生物功能化的石墨烯包裹聚苯乙烯复合纳米球的混合溶液滴涂于上述洁净的玻碳电极表面，并置于冷藏低温环境下晾干；

(4)将生物素化的抗体滴涂在上述链霉素生物功能化的修饰材料表面，室温下反应后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗。

(5)将封闭液牛血清蛋白滴涂于上述修饰层表面，在室温下封闭后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗。

进一步地，所述无标记电化学免疫传感器的制备方法的步骤(1)中，所述聚苯乙烯/石墨烯复合粒子用量为2.0～4.0mg/mL，壳聚糖溶液的浓度为1.0～2.0wt％，链霉亲和素的浓度为400～600μg/mL，步骤(2)中，所述的氧化铝粉粒径为0.05mm。

进一步地，所述无标记电化学免疫传感器的制备方法的步骤(3)中，所述冷藏低温为4℃；步骤(4)中，所述生物素化的抗体浓度为1～10μg/mL。