[发明专利]利用线粒体分子标记鉴定牧草盲蝽种群的方法

权利要求书

1.用于鉴定牧草盲蝽种群的PCR引物组合，其特征在于，所述引物组合包括引物对①～④中的至少两种：①PCR扩增牧草盲蝽线粒体细胞色素氧化酶II基因的引物对，②扩增细胞色素b基因的引物对，③扩增线粒体NADH脱氢酶亚基5基因的引物对；④扩增16SrDNA的引物对；引物序列如下：

①L-COII-F：5'–TGGCAGAATAAGTGCCATGA–3'

L-COII-R：5'–GAGACCAATGCTTTCTTTCAGC–3'

②L-ND5-F：5'–AAACATAATTACCTGAACCCATGAA–3'

L-ND5-R：5'–TCTTCAACTTTAGTAACTGCAGGAG–3'

③L-Cytb-F：5'–TCTAATTGATCTTCCTAGCCCAAG–3'

L-Cytb-R：5'–CCGTGCTCCAATTCATGTTA–3'

④L-16S-F：5'–TCCACAAATATCCCCAATCTG–3'

L-16S-R：5'–CCTTGAAATGTCCCTTCTCG–3'。

2.根据权利要求1所述的PCR引物组合，其特征在于，所述引物组合包括引物对①～④。

3.含有权利要求1或2所述引物组合的用于鉴定牧草盲蝽种群的PCR检测试剂盒。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、标准阳性模板中的至少一种。

5.利用线粒体分子标记鉴定牧草盲蝽种群的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测牧草盲蝽的基因组DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用权利要求1或2所述引物对①～④分别进行PCR扩增反应；

3)纯化并分析PCR产物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR反应体系为：5×PCR反应缓冲液5μL，10mMdNTPs0.5μL，5U/μlTaqDNA聚合酶0.5μL，10μM上、下游引物各1μL，模板DNA2μL，无菌水补足至25μL。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

8.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中分别对PCR产物进行纯化和测序后，将测序结果按照COII-ND5-Cytb-16SrDNA串联拼接，串联序列大小为3190bp，新疆种群第300、543、1204、1279、1981、2509、2999、3161bp处碱基依次为A、A、T、G、A、A、A、C，甘肃宁夏种群依次为G、G、C、A、G、G、G、T。