[发明专利]利用线粒体分子标记鉴定牧草盲蝽种群的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种利用线粒体分子标记鉴定牧草盲蝽种群的方法。

背景技术

牧草盲蝽(Lyguspratensis)属于盲蝽科(Miridae)草盲蝽属(Lygus)，为棉田重要的害虫种类之一，尤其是近十年来，随着转基因棉花的大量种植，伴随着化学农药的减少使用，该虫已经从次要害虫上升为主要害虫，特别是我国的西北棉区呈急剧上升趋势。牧草盲蝽种群数量大范围内的明显增加和空间范围的扩张给防治工作带来很大挑战。

大量的研究表明牧草盲蝽虽然在中国西北地区种群数量大且危害严重，但该昆虫的外部形态特征在不同地理种群间差异并不明显，很难进行区分，因此通过外部形态特征实现不同地区种群的鉴定是非常困难的。线粒体基因在遗传过程中严格遵守母系遗传，进化速率快，在短时间内即能完成谱系分化，因此利用线粒体分子标记对牧草盲蝽新疆地区和甘肃、宁夏地区种群进行鉴定是一种非常可靠的分子生物学方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用线粒体分子标记快速鉴定牧草盲蝽种群的方法，特别是对新疆种群以及甘肃、宁夏种群进行鉴别。

为了实现本发明目的，本发明提供用于鉴定牧草盲蝽种群的PCR引物组合，所述引物组合包括引物对①～④中的至少两种：①PCR扩增牧草盲蝽线粒体细胞色素氧化酶II基因的引物对，②扩增细胞色素b基因的引物对，③扩增线粒体NADH脱氢酶亚基5基因的引物对；④扩增16SrDNA的引物对；引物序列如下：

①L-COII-F：5'–TGGCAGAATAAGTGCCATGA–3'

L-COII-R：5'–GAGACCAATGCTTTCTTTCAGC–3'

②L-ND5-F：5'–AAACATAATTACCTGAACCCATGAA–3'

L-ND5-R：5'–TCTTCAACTTTAGTAACTGCAGGAG–3'

③L-Cytb-F：5'–TCTAATTGATCTTCCTAGCCCAAG–3'

L-Cytb-R：5'–CCGTGCTCCAATTCATGTTA–3'

④L-16S-F：5'–TCCACAAATATCCCCAATCTG–3'

L-16S-R：5'–CCTTGAAATGTCCCTTCTCG–3'

优选所述引物组合包括引物对①～④。

本发明还提供含有所述引物组合的用于鉴定牧草盲蝽种群的PCR检测试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、标准阳性模板等中的至少一种。

本发明还提供利用线粒体分子标记鉴定牧草盲蝽种群的方法，包括以下步骤：

1)提取待测牧草盲蝽的基因组DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用引物对①～④分别进行PCR扩增反应；

3)纯化并分析PCR产物。

PCR反应体系为：5×PCR反应缓冲液5μL，10mMdNTPs0.5μL，5U/μlTaqDNA聚合酶0.5μL，10μM上、下游引物各1μL，模板DNA2μL，无菌水补足至25μL。

PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

前述的方法，步骤3)中分别对PCR产物进行纯化和测序后，将测序结果按照COII-ND5-Cytb-16SrDNA串联拼接，串联序列大小为3190bp，新疆种群第300、543、1204、1279、1981、2509、2999、3161bp处碱基依次为A、A、T、G、A、A、A、C，甘肃宁夏种群依次为G、G、C、A、G、G、G、T。

将上述位点作为分子标记，从而实现对我国牧草盲蝽种群，特别是新疆种群以及甘肃、宁夏种群的鉴定。

本发明提供的分子鉴别方法简单可靠，可操作性强，稳定性好，可重复性强。

附图说明

图1为本发明实施例1中牧草盲蝽新疆种群和甘肃、宁夏种群的线粒体细胞色素氧化酶II(COII)、细胞色素b(Cytb)、线粒体NADH脱氢酶亚基5(ND5)和16SrDNA，四个基因片段的串联序列比对结果；其中，“*”表示相同碱基。