[发明专利]一种海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵提取物及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵提取物，其特征在于，是由海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵液经过提取得到，所述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005于2016年1月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.12105；保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；所述发酵提取物具有抗老年痴呆、抗氧化和/或抑制乙酰胆碱酯酶活性；所述发酵提取物提取的方法如下：

（1）提取：培养结束后得到的发酵液，用500mL乙酸乙酯过夜杀菌，然后超声处理30min，加入硅藻土抽滤，滤液用等体积乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯提取物；滤饼用200mL甲醇浸泡12～24h后，超声30min，抽滤，得到甲醇提取物；如此重复2次；

（2）将乙酸乙酯提取物和甲醇提取物分别用旋转蒸发仪于45℃减压浓缩，最后合并提取物并离心后，继续用旋转蒸发仪于45℃减压蒸干，得到一份干固体，为总活性粗提物，即得到所述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵提取物。

2.根据权利要求1所述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵提取物，其特征在于，所述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵液的获得方法如下：将海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005接种于灭菌的液体培养基中，自然光照28℃培养21～24天；其中，所述液体培养基的制备方法为：每500mL马铃薯煮汁中加入20.0g蔗糖和20.0g海盐，自然pH值；所述马铃薯煮汁为：取新鲜马铃薯去皮切成1cm³大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500mL煮沸20min，双层脱脂纱布过滤，并以蒸馏水定容至500mL。

3.根据权利要求2所述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵提取物，其特征在于，所述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵液的获得方法如下：

（1）种子培养：将菌种从斜面上接种到无菌的种子固体培养基平板上，将培养皿平板置于恒温培养箱中28℃下倒置培养，培养时间为4～5天；

（2）扩大培养：将1L液体培养基灌装到3L三角瓶中，用透气封口膜封口后于高压灭菌锅中121℃、0.1 Mpa灭菌20min；冷却后按照每1000mL液体培养基接种上述步骤（1）培养后的种子平板带菌培养基块40～80cm²的比例接种，封口，置于恒温培养箱中培养，自然光照，培养时间为21～24天，得到发酵液；

其中，所用到的培养基如下：

种子固体培养基为：每500mL马铃薯煮汁中加入20.0g蔗糖、20.0g海盐和15.0g琼脂，自然pH值；

液体培养基为：每500mL马铃薯煮汁中加入20.0g蔗糖和20.0g海盐，自然pH值；

其中，马铃薯煮汁：取新鲜马铃薯去皮切成1cm³大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500mL煮沸20 min，双层脱脂纱布过滤，并以蒸馏水定容至500mL。

4.权利要求1～3任一所述发酵提取物在制备抗老年痴呆药物方面的应用。

5.权利要求1～3任一所述发酵提取物在制备抗氧化药物和/或抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物方面的应用。

6.一种海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的发酵活性物质，其特征在于，是由权利要求1～3任一所述发酵提取物再经过提纯所得，所述提纯的方法为：将发酵提取物溶于5～20mL甲醇，加入到与其干重相等的100～200目硅胶，混合并研磨均匀至干燥，上样于20～50倍样品干重的200～300目硅胶层析柱上，用洗脱剂逐步梯度洗脱，所用洗脱剂为氯仿：丙酮=25：1～0：1（v/v），采用薄层色谱生物活性自显影法追踪活性组分；

将有活性组分的组份样品采用反相液相色谱的方法进行进一步纯化得到；反相液相色谱的条件为：色谱柱SinoChrom ODS-AP，粒径15µm，尺寸为20.0 mm×250 mm，流动相为甲醇：水=8：2，流速为2 mL/min，峰的保留时间在4～9 min；所述发酵活性物质具有抗老年痴呆、抗氧化和/或抑制乙酰胆碱酯酶活性。