[发明专利]一种高灵敏检测黄曲霉毒素的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种快速检测食品中黄曲霉毒素的新方法，主要将现行黄曲霉毒素的柱前衍生技术与柱后衍生技术结合，柱前衍生反应在紫外光线照射下进行，使衍生反应进行的完全且产生的荧光强，衍生产物荧光稳定性好，同时又提高了检测灵敏度。与现有标准中黄曲霉毒素测定方法相比，该法具有检测灵敏度高，不需要柱后光衍生设备，重现性好、准确等特点。

技术领域

本发明涉及一种高灵敏检测黄曲霉毒素的方法及其应用。属于检测技术领域。

背景技术

黄曲霉毒素(aflatoxin,AFT)是一类由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的一类含有二氢呋喃环结构次级代谢物，是迄今发现的毒性最强的一类真菌毒素，目前已发现的有20多种，在食品中较常见的包括黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1等，它们毒性大小的排列顺序为AFTB1＞AFTM1＞AFTG1＞AFTB2＞AFTG2。黄曲霉毒素对动物及人体的危害主要是肝脏损害，可引发肝炎、肝硬化、肝部坏死、肝癌等疾病，是诱发恶性肿瘤原发性肝细胞癌的主要因素之一。黄曲霉毒素常存在于玉米、谷物、花生及其他坚果中。

黄曲霉毒素检测过程中，由于B1和G1的荧光检测灵敏度低，通常需要衍生增强荧光，以提高检测器对目的物的响应。目前衍生的方法主要有柱前三氟乙酸衍生法和柱后碘衍生法及光化学衍生法。光化学柱后衍生是目前检测黄曲霉毒素的最常用方法，柱后光化学衍生反应原理是利用环状化合物在紫外光照射下能产生荧光这一特性，通过紫外光使流动相中光解出光子，与AFB1和AFG1分子上的活性双键发生反应，产生了荧光特性更强且更稳定的物质，解决了AFB1和AFG1在水溶液中的荧光淬灭现象。

国家标准GB/T 18979-2003食品中黄曲霉毒素测定，采用高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生测定黄曲霉毒素的含量，总量检出限为1μg/kg；国家标准GB/T 5009.23-2006食品中黄曲霉毒素测定，采用高效液相色谱仪柱前衍生测定黄曲霉毒素的含量，AFB1和AFG1检出限为0.2μg/kg。

目前的HPLC测定黄曲霉毒素或者是用柱前衍生或者是柱后衍生结合荧光测定。但也存在柱前衍生后荧光不稳定及附加柱后衍生设备的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单，灵敏度高，检测时间短的黄曲霉毒素的测定方法。

一种高灵敏检测黄曲霉毒素的方法及其应用，包括以下步骤：

(1)工作曲线的制作：分别配制黄曲霉毒素B10.5～200ng/mL、黄曲霉毒素G10.5～100ng/mL的标准溶液，加入一定量的衍生试剂，在紫外灯下照射一定时间进行衍生反应，在选定色谱条件下进高效液相色谱进行测定，得到黄曲霉毒素回归方程、相关系数、相对标准偏差、回收率。

(2)样品提取：

①对于大米、玉米、小麦、花生、核桃、杏仁及其制品及中药提取方法为：准确称取粉碎均质后的样品2～5g，精确至0.0001g，加入体积分数为70～80％的乙腈水溶液20～50mL，剧烈振荡1min，50±2℃水浴超声提取20～30min，以3500～5000r/min离心5～10min，取出上层溶液，重复提取2～3次，合并上清液，待用；或者

②对于酱油、食醋、植物油脂提取方法为：准确称取5.00～10.00g样品，加入2～5gNaCl和体积分数为70～80％的乙腈水溶液20～50mL，涡旋混合1～3min，定量滤纸过滤，准确吸取5.00mL滤液，加入10mL超纯水稀释，混匀，待用。

(3)样品测定

取步骤(2)中的提取液，按照步骤(1)进行荧光衍生，在与步骤(1)相同色谱条件进行HPLC分析，并对照步骤(1)所得的线性回归方程，计算样品中黄曲霉毒素的含量。

所述的食品样品中待测黄曲霉毒素包括：黄曲霉毒素B1、G1。