[发明专利]一种提取棉花线粒体及其蛋白质的方法

权利要求书

1.一种提取植物线粒体蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)将植物样品进行匀浆，过滤，收集滤液；将所述滤液进行差速离心，收集沉淀；

(2)洗涤步骤(1)获得的沉淀，得到体系A，将所述体系A进行差速离心，收集沉淀；

(3)向步骤(2)获得的沉淀中加入Buffer B溶液，进行蔗糖密度梯度离心，收集梯度36％与梯度52％之间的黄色液体层，即得到线粒体；

所述蔗糖密度梯度离心的蔗糖密度梯度为将60％蔗糖溶液、52％蔗糖溶液、36％蔗糖溶液和20％蔗糖溶液分层制备，得到蔗糖密度梯度；

(4)从步骤(3)获得的线粒体中提取蛋白；

所述步骤(3)和步骤(4)间还包括如下纯化的步骤：用Buffer B⁺溶液洗涤梯度36％与梯度52％之间的黄色液体层，离心，弃上清液，收集沉淀，得到的沉淀即为线粒体；所述洗涤的次数为4次；

所述步骤(1)的匀浆过程中使用匀浆缓冲液，所述匀浆缓冲液的溶剂为水，溶质及其在匀浆缓冲液中的浓度为：蔗糖100-500mM、EDTA-Na₂ 5-10mM、KCl 5-20mM、KH₂PO₄ 10-20mM、BSA 0.5-1.0g/L、二硫苏糖醇0.77-1.54g/L、β-巯基乙醇0.5-1.0ml/L；所述匀浆缓冲液的pH值为7.5-8.5；

所述步骤(2)的洗涤过程中使用Buffer B溶液，所述Buffer B溶液的溶剂为水，溶质及其在洗涤缓冲液中的浓度为：蔗糖100-500mM、EDTA-Na₂ 5-10mM、KCl 5-20mM、KH₂PO₄10-20mM、Tris-HCl 5-20mM；

所述Buffer B⁺溶液为在所述洗涤缓冲液中添加BSA得到的溶液；所述BSA在所述BufferB⁺溶液中的质量分数为0.05-0.10％；

所述步骤(1)中，所述差速离心的步骤为：将滤液进行低速离心，弃沉淀，取上清液；将所述上清液进行高速离心，弃上清液，收集沉淀；所述低速离心的条件为500-2000×g离心5-15min；所述高速离心的条件为10000-15000×g离心30-60min；

所述步骤(2)中，所述差速离心的步骤为：将体系A进行低速离心，弃沉淀，取上清液；将所述上清液进行高速离心，弃上清液，收集沉淀；所述低速离心的条件为500-1000×g离心10-20min，所述高速离心的条件为15000-18000×g离心30-60min；

所述步骤(3)中，所述蔗糖密度梯度离心的条件为50000-100000×g，4℃离心60-120min；

所述纯化步骤中，所述离心的条件为50000-100000×g离心25-30min；

所述从步骤(3)获得的线粒体中提取蛋白包括如下步骤：

1)向步骤(3)获得的线粒体中加入裂解液，裂解反应，得到裂解反应产物；

2)向所述裂解反应产物中加入苯酚抽提液，反应，离心，弃沉淀，收集上清液；

3)将步骤2)获得的上清液与5倍体积的乙酸铵/甲醇溶液混匀，反应，离心，弃上清液，收集沉淀；

4)用乙酸铵/甲醇溶液洗涤步骤3)获得的沉淀，静置，离心，弃上清液，收集沉淀；

5)用80％丙酮溶液洗涤步骤4)获得的沉淀，静置，离心，弃上清液，收集沉淀；

6)重复步骤5)；

7)用体积分数为70％乙醇洗涤步骤6)获得的沉淀，静置，离心，弃上清液，收集沉淀；并将所述沉淀悬浮于体积分数为80％的丙酮中，静置过夜；

8)离心步骤7)获得的产物，弃上清液，收集沉淀，得到的沉淀即为线粒体蛋白；

所述60％蔗糖溶液、所述52％蔗糖溶液、所述36％蔗糖溶液、所述20％蔗糖溶液的体积比为4:5:5:3；

所述20％蔗糖溶液的溶质为蔗糖，溶剂为0.1M pH为8.0的Tris-HCl，所述蔗糖在所述20％蔗糖溶液中的浓度为0.20g/ml；

所述36％蔗糖溶液的溶质为蔗糖，溶剂为0.1M pH为8.0的Tris-HCl，所述蔗糖在所述36％蔗糖溶液中的浓度为0.36g/ml；

所述52％蔗糖溶液的溶质为蔗糖，溶剂为0.1M pH为8.0的Tris-HCl，所述蔗糖在所述52％蔗糖溶液中的浓度为0.52g/ml；

所述60％蔗糖溶液的溶质为蔗糖，溶剂为0.1M pH为8.0的Tris-HCl，所述蔗糖在所述60％蔗糖溶液中的浓度为0.60g/ml；

所述裂解液的溶剂为水，溶质及其在所述裂解液中的浓度分别为Tris-HCl 0.005-0.020mol/L、EDTA-Na₂ 0.01-0.05mol/L、CTAB 1.0-3.0g/L、聚乙烯吡咯烷酮1.0-3.0g/L、NaCl 1.0-1.8mol/L；

所述苯酚抽提液是将pH 8.0的Tris饱和酚与等体积提取缓冲液混匀得到的溶液；

所述提取缓冲液的溶剂为水，溶质及其在所述提取缓冲液中的浓度分别为Tris-HCl0.05-0.10mol/L、SDS 15-25g/L、蔗糖200-400g/L、β-巯基乙醇1-2ml/L；

所述乙酸铵/甲醇溶液的溶剂为甲醇，溶质为乙酸铵，所述乙酸铵在所述甲醇中的浓度为0.05-0.20mol/L；

所述步骤1)中，所述裂解反应的条件为65℃裂解10-30min；

所述步骤2)中，所述反应的条件为4℃反应30min；所述离心的条件为2000-5000×g，4℃离心20-40min；

所述步骤3)中，所述反应条件为-20℃过夜；所述离心的条件为2000-5000×g，4℃离心20-40min；

所述步骤4)、5)和7)中，所述静置的条件为-20℃静置20min；所述离心的条件为8000-12000×g，4℃下离心20-40min；

所述步骤8)中，所述离心的条件为18000-20000×g离心2-10min。