[发明专利]一种提取棉花线粒体及其蛋白质的方法

说明书

本发明公开了一种提取棉花线粒体及其蛋白的方法。本发明的方法对线粒体机械损伤程度最小，可以有效的除去线粒体以外的核组分、质体组分，以及酚类、多糖类物质，降低污染率，提高线粒体蛋白质的纯度和质量。满足了棉花基因组研究、线粒体蛋白组及代谢调控网络等研究工作的实验技术需求，拓宽了相关研究工作的领域。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提取棉花线粒体及其蛋白的方法。

背景技术

线粒体蛋白质的提取主要分为线粒体分离和蛋白质提取两个环节。目前，用于高等植物线粒体分离提取的方法主要有差速离心法和密度梯度离心法等。差速离心法，虽然操作简单，是目前应用最广的方法，但所提取的线粒体纯度低、容易受核杂质污染，对后续的研究工作造成很大困难；密度梯度离心法，得到的线粒体纯度高，但操作复杂、耗时，长时间高速离心对离心机要求很高，对材料的需求量大，同时线粒体提取产量低。

线粒体具有相对独立的遗传物质，植物细胞中，线粒体蛋白质仅占总蛋白质的约5％，因此，分离出高纯度的线粒体蛋白质，对于研究线粒体的蛋白组等都是必需的。和其他作物相比，棉花线粒体DNA，RNA和蛋白质的提取都较为困难，目前还没有关于棉花线粒体蛋白质提取方法的报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种提取植物线粒体蛋白的方法。

本发明提供的提取植物线粒体蛋白的方法包括如下步骤：

(1)将植物样品进行匀浆，过滤，收集滤液；将所述滤液进行差速离心，收集沉淀；

(2)洗涤步骤(1)获得的沉淀，得到体系A，将所述体系A进行差速离心，收集沉淀；

(3)向步骤(2)获得的沉淀中加入Buffer B溶液，进行蔗糖密度梯度离心，收集梯度36％与梯度52％之间的黄色液体层，即得到线粒体；

所述蔗糖密度梯度离心的蔗糖密度梯度为将60％蔗糖溶液、52％蔗糖溶液、36％蔗糖溶液和20％蔗糖溶液分层制备，得到蔗糖密度梯度；

(4)从步骤(3)获得的线粒体中提取蛋白。

上述方法中，所述从步骤(3)获得的线粒体中提取蛋白包括如下步骤：

1)向步骤(3)获得的线粒体中加入裂解液，裂解反应，得到裂解反应产物；

2)向所述裂解反应产物中加入苯酚抽提液，反应，离心，弃沉淀，收集上清液；

3)将步骤2)获得的上清液与5倍体积的乙酸铵/甲醇溶液混匀，反应，离心，弃上清液，收集沉淀；

4)用乙酸铵/甲醇溶液洗涤步骤3)获得的沉淀，静置，离心，弃上清液，收集沉淀；

5)用80％丙酮溶液洗涤步骤4)获得的沉淀，静置，离心，弃上清液，收集沉淀；

6)重复步骤5)；

7)用体积分数为70％乙醇洗涤步骤6)获得的沉淀，静置，离心，弃上清液，收集沉淀；并将所述沉淀悬浮于体积分数为80％的丙酮中，静置过夜；

8)离心步骤7)获得的产物，弃上清液，收集沉淀，得到的沉淀即为线粒体蛋白。

上述方法中，

所述60％蔗糖溶液、所述52％蔗糖溶液、所述36％蔗糖溶液、所述20％蔗糖溶液的体积比为4:5:5:3；

所述20％蔗糖溶液的溶质为蔗糖，溶剂为0.1M pH为8.0的Tris-HCl，所述蔗糖在所述20％蔗糖溶液中的浓度为0.2g/ml；

所述36％蔗糖溶液的溶质为蔗糖，溶剂为0.1M pH为8.0的Tris-HCl，所述蔗糖在所述36％蔗糖溶液中的浓度为0.36g/ml；